《The FASEB Journal》：Testosterone Exposure During Fetal Masculinization Programming Window Determines the Kidney Size in Adult Mice
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为解决雄性激素发育缺乏如何影响肾脏发育的问题，研究人员开展了关于胎睾酮暴露在胚胎期雄性化编程窗口（E14.5–17.5）对成年小鼠肾脏大小调控机制的研究。他们利用HSD17B3酶敲除小鼠模型，发现其胚胎期睾酮短暂缺乏导致成年后肾脏体积减小、肾单位数量减少及近端小管细胞增殖降低，而宫内睾酮补充可挽救此表型。研究揭示了AR与HNF4A可能通过共同调控IGFBP5，进而影响FOXO1和mTOR信号通路，以促进雄性特异性肾脏生长的发育编程新机制，为理解人类性发育障碍及相关肾脏疾病风险提供了新视角。
在人类和小鼠中，肾脏的大小存在明显的性别二态性，并且受到雄激素的调控。成年雄性通常拥有比雌性更大的肾脏。以往的研究已经证实，成年期的雄激素剥夺和补充可以快速、可逆地改变肾脏近端小管的细胞大小和数量，从而影响整个器官的大小。然而，一个长期悬而未决的关键问题是：生命早期，特别是胚胎发育阶段的雄激素暴露，是否会对肾脏最终的生长潜力和大小产生“编程”般的持久影响？换言之，如果胚胎期雄激素信号出现短暂异常，即使成年后拥有正常的甚至高水平的雄激素，肾脏还能长到正常雄性的大小吗？这个问题对于理解性发育障碍患者的长期健康，以及环境内分泌干扰物可能带来的远期影响，具有重要意义。
为了回答这个问题，以A. J.等研究人员为核心的国际团队开展了一项深入的研究，其成果发表在《The FASEB Journal》上。他们巧妙地利用了一种基因敲除小鼠模型——Hsd17b3?/?小鼠。HSD17B3是催化雄烯二酮转化为高活性睾酮的关键酶。这种雄性小鼠在成年后循环睾酮水平很高，但却表现出包括肾脏缩小在内的雄性化不足表型。这提示，问题可能出在更早的发育阶段。
研究人员开展了一系列精巧的实验。首先，他们通过气相色谱-串联质谱法精准测量了胚胎睾丸中的类固醇激素，证实Hsd17b3?/?雄性在胚胎第15.5天（E15.5）确实存在睾酮缺乏，但到E18.5时已通过代偿机制恢复正常，形成了一个短暂的“雄激素缺乏窗口期”。这个窗口恰好与已知的雄性生殖系统“雄性化编程窗口”（E15.5–E17.5）重叠。为了验证这个窗口期对肾脏的决定性作用，他们在怀孕母鼠的E14.5至E17.5天进行了睾酮丙酸盐的宫内补充实验。在组织学层面，他们采用免疫组织化学和免疫荧光技术，定位了雄激素受体在肾脏的表达，并使用多种抗体标记物分析了肾单位发育阶段、细胞增殖和特定蛋白的表达。通过苏木精-伊红染色、免疫荧光共定位（如LRP2标记近端小管，pHH3标记增殖细胞）和图像分析软件，量化了肾小球数量、近端小管面积、细胞数量和大小。在分子机制探索上，他们结合了RNA测序、定量PCR、Western blot蛋白质印迹分析以及对已发表的染色质免疫共沉淀测序数据的再分析，系统性地研究了基因表达变化和信号通路。
3.1 成年Hsd17b3?/?雄性小鼠肾脏体积减小
研究证实，3月龄的Hsd17b3?/?雄性小鼠肾脏绝对重量和相对于体重的比例均显著小于野生型对照。虽然肾脏形态正常，但通过免疫荧光染色计数发现，其2周龄时的肾小球数量减少了约15%。
3.2 HSD17B3的缺失导致胎儿期雄激素产生延迟
关键发现是，Hsd17b3?/?雄性胚胎在E15.5时睾丸内睾酮水平骤降，而前体雄烯二酮水平升高，但到E18.5时两者水平均恢复正常。这表明缺陷仅限于一个短暂的胎儿期窗口。
3.3 胎儿期雄激素缺乏影响AR表达近端小管的基因表达和细胞增殖
雄激素受体在Hsd17b3?/?和野生型小鼠的肾脏中表达模式和位置相同，均特异性位于近端小管。在E18.5的Hsd17b3?/?肾脏中，与组织大小调控相关的肝细胞核因子基因Hnf1b和Hnf4a的mRNA水平下调。更重要的是，细胞增殖分析显示，在E18.5和出生后2周，Hsd17b3?/?肾脏近端小管上皮中增殖细胞的数量显著减少。这导致2周龄时皮质区近端小管相对面积减小，并在成年后表现为近端小管横截面积和细胞数量的减少。
3.4 胎儿期睾酮补充可挽救成年肾脏表型
核心干预实验证明，在E14.5至E17.5天对怀孕母鼠进行睾酮补充，不仅能挽救Hsd17b3?/?雄性后代肛门生殖器距离缩短的表型，还能使其成年后的肾脏重量完全恢复正常至野生型水平。这直接证明了胎儿期特定窗口的雄激素暴露对编程成年肾脏大小具有不可或缺的作用。
3.5 雄激素缺乏下调Igfbp5表达，影响细胞增殖和信号传导
通过对E16.5肾脏的RNA测序数据分析，研究人员从众多基因中聚焦于胰岛素样生长因子结合蛋白5编码基因Igfbp5。该基因在Hsd17b3?/?肾脏中表达下调，并可被胎儿期睾酮补充所逆转。生物信息学分析显示，Igfbp5基因座存在AR和HNF4A的共同结合位点。实验证实，在E18.5的Hsd17b3?/?肾脏中，IGFBP5蛋白水平降低，且该蛋白定位于近端小管。功能上，在培养的HEK 293细胞中添加重组IGFBP5可促进细胞增殖。进一步的通路分析将IGFBP5的下调与FOXO1和mTOR信号通路的改变联系起来。尽管磷酸化S6核糖体蛋白水平在E15.5的缺陷肾脏中意外升高，但AKT的磷酸化水平在E18.5有降低趋势，且Mtor和Foxo1的转录水平下调，提示IGFBP5可能是连接早期雄激素信号与肾脏生长调控网络的关键节点。
这项研究得出的核心结论是，肾脏的雄性特异性生长不仅受成年期雄激素的急性调控，更在胎儿期经历一个关键的“编程窗口”。位于E15.5至E17.5天的短暂睾酮暴露，通过雄激素受体和HNF4A的协同作用，调控近端小管中IGFBP5等因子的表达，从而设定肾脏的生长轨迹，影响后续的细胞增殖和肾单位形成。一旦错过这个窗口，即使青春期后拥有高水平的雄激素，也无法使肾脏达到完全的雄性大小。这揭示了一种全新的肾脏发育编程机制。
这项研究的意义深远。首先，它拓展了“雄性化编程窗口”的概念，从传统的生殖器官延伸到了肾脏这一重要代谢和排泄器官。其次，它深刻揭示了人类HSD17B3缺乏症等性发育障碍患者可能存在的远期健康风险。这些患者胎儿期存在类似的雄激素缺乏，青春期后虽能部分雄性化，但根据本研究，其肾脏可能已因早期编程而潜在地缩小、肾单位减少，这可能增加未来患慢性肾脏病、高血压等疾病的风险。此外，研究结果对理解环境内分泌干扰物在关键发育窗口的潜在危害也提供了重要理论依据。最后，研究提示的AR/HNF4A/IGFBP5信号轴，为干预雄激素相关的肾脏生长异常提供了潜在的分子靶点。总之，这项工作将肾脏的性别二态性研究从现象描述和成年期调控，推进到了发育起源的机制探索，具有重要的生物学意义和临床启示价值。
