一种通过光照激活的荧光素衍生物，具有意想不到的结构，可用于检测硫化氢

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A light-promoted activation fluorescein derivative with unexpected structure for sensing hydrogen sulfide

硫化氢检测、荧光探针、五氟苯磺酰氯、光活化机制、灵敏度

　　

程雅丽|贾新月|曹书久|黄炳轩|肖娜奥|高代全|陶晓梅|马登科|王宇吉

中国北京100069，首都医科大学药学院肽与小分子药物重点实验室

摘要

硫化氢（H₂S）作为一种信号分子参与多种生理过程，并在食品安全监测中作为腐败的指示物。然而，由于实际环境中其浓度较低且样品复杂性较高，准确检测硫化氢仍然具有挑战性。本文报道了一种新型的光激活荧光探针Fl-F-Me，该探针基于亲核反应机制用于硫化氢的检测。通过单晶X射线衍射验证，该探针以氧甲基荧光素（一种结构独特的荧光素衍生物）作为荧光团，以及传统上用于检测过氧化氢（H₂O₂）的五氟苯磺酰（PFBS）作为硫化氢识别单元。在365纳米（UV）紫外光照射下激活后，Fl-F-Me对硫化氢表现出优异的选择性、抗干扰能力、快速响应，并且在pH值5至11的范围内具有生理适用性的灵敏度：检测限（LOD）为0.026微摩尔，定量限（LOQ）为0.086微摩尔。该探针已成功应用于食品和水样中硫化氢含量的测定，揭示了植物细胞在铝胁迫下的硫化氢生成情况，并可视化了斑马鱼幼体和成体中的内源性和外源性硫化氢动态。这些发现表明Fl-F-Me是一种多功能硫化氢传感器，在农业生产、食品工业和生物医学研究中具有广泛应用前景。

引言

硫化氢（H₂S）以其刺鼻的气味和显著的毒性而闻名，即使在低剂量下也会导致严重的健康问题[1]、[2]。它通常由富含蛋白质的食物（如肉类、鱼类）在变质过程中产生[3]，并且在发酵工业中微量存在时也会影响食品质量[4]、[5]。硫化氢与一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）一样，被认为是生物系统中的重要气体信号分子[6]、[7]、[8]，参与多种生理过程，如血管扩张、神经传递、炎症调节和细胞凋亡[9]、[10]，并具有抗炎、抗癌和抗氧化应激作用[11]、[12]、[13]。内源性硫化氢主要由半胱氨酸（Cys）及其衍生物合成[14]、[15]，这种平衡的失调与神经退行性疾病、糖尿病和肝脏损伤有关[16]、[17]、[18]。因此，开发高精度和生物相容性的硫化氢检测方法对于食品安全监测和临床诊断至关重要。

荧光探针作为一种强大的工具，用于研究小分子与疾病之间的关联，因其非侵入性、高灵敏度和实时成像能力而受到重视[19]、[20]、[21]。与传统检测方法[22]、[23]相比，这种技术能够实时监测活细胞和组织中的硫化氢动态并进行原位成像，为阐明硫化氢的生物功能提供了有力平台。基于荧光素及其衍生物的荧光探针因其优异的光物理性质、良好的生物相容性和结构可调性而备受关注[24]、[25]。荧光素基探针的优势体现在三个方面：首先，它们具有高摩尔吸收系数、高荧光量子产率和良好的光稳定性，从而在检测过程中产生强烈且稳定的荧光信号[26]、[27]；其次，它们的螺内酯环开环平衡是荧光调节的核心机制，在碱性或中性条件下，螺内酯环开环会产生高度共轭的醌结构，从而激活强烈的荧光。这一过程对pH值和特定分析物（如金属离子和生物硫醇）非常敏感，可作为构建多种传感系统的有效“开关”[28]、[29]；第三，荧光素骨架上的多个可修饰位点（如酚羟基和羧基）便于引入不同的识别基团，实现目标分析物的高选择性和高灵敏度检测[30]、[31]。

在传统的荧光素基探针设计中，通常在3′-位点的酚羟基进行修饰，这种设计原则基于荧光素本身的荧光切换特性[32]、[33]、[34]。通过醚键或酯键将识别单元连接到酚羟基上，可以阻止螺内酯环的开环，使探针保持低荧光状态。当目标分析物与识别基团反应并导致键断裂后，释放的酚羟基会引发螺内酯环的开环，恢复共轭结构并增强荧光（图1A）[35]、[36]、[37]。这种设计的探针具有低背景荧光、高信噪比和广泛的适用性，这对于它们的广泛应用至关重要。

在硫化氢荧光探针的设计中，磺酸酯被广泛用作识别基团[38]，其中2,4-二硝基苯磺酸酯尤为突出[39]、[40]、[41]。其作用机制依赖于硫化氢（H₂S）的强亲核性，H₂S中的HS^?攻击磺酸酯中的磺酰硫，引发亲核取代反应，断裂键并释放荧光团，从而产生荧光信号[42]、[43]。然而，并非所有磺酸酯都适合用于硫化氢的检测，因为它们的反应性取决于芳香环上的吸电子取代基和荧光团的性质[44]、[45]。因此，将五氟苯磺酰（PFBS）引入硫化氢识别系统值得进一步研究。研究表明，PFBS作为一种高反应性基团，已被用于过氧化氢（H₂O₂的检测，其作用机制同样依赖于亲核攻击引发的键断裂，这为其在硫化氢检测中的扩展应用提供了依据（图1C）[46]、[47]、[48]、[49]、[50]、[51]。

荧光探针的光调控策略正在从可逆控制向协同激活转变。传统上，通过引入光致变色单元，探针可以在光照下发生可逆的光异构化，实现对荧光行为的时空控制。虽然这类探针具有良好的可逆性和循环稳定性，但其功能主要局限于荧光切换本身[52]、[53]。近年来，出现了一类新的反应模式，将光激活与分子识别相结合，标志着从状态控制向反应启用的转变。这种策略利用光作为外部触发剂在原位激活探针分子。光不仅直接产生荧光，还诱导电子重组或形成高反应性的中间体，大大降低了后续化学转化的能量障碍。目标分析物随后高效地识别并触发与光激活探针的不可逆反应，最终产生快速且特异的荧光信号（图1B）[54]、[55]、[56]。这种基于光激活和分子识别的协同机制有效地结合了光的时空控制与分子反应的选择性，为高信噪比、高选择性成像和分析复杂生物系统中低丰度生物分子提供了下一代工具箱。

在这项工作中，我们提出了一种新型的硫化氢荧光探针Fl-F-Me，它结合了异构化荧光素的催化特性和重新设计的PFBS识别特异性。首先，我们将识别基团置于荧光团核心的2′-位置，而不是传统的3′-位置，从而提供了一个全新的平台来调节光物理和化学性质。其次，我们首次提出PFBS作为一种特定的、光激活的硫化氢/HS^?识别单元，具有时空可控的生物传感潜力。其响应机制基于HS^?对磺酸酯键的亲核攻击，其中强吸电子的五氟苯环使SO键更容易在紫外（UV）照射下被HS^?攻击。实验表明，Fl-F-Me具有长波长兼容性、在UV照射下的快速响应、对硫化氢的优异选择性、抗干扰能力，以及0.026微摩尔的检测限（LOD）和0.086微摩尔的定量限（LOQ），支持生理检测（1纳摩尔至100微摩尔）[1]。我们已成功将该探针应用于揭示食品变质过程中的硫化氢生成、测定各种水样中的硫化氢含量，以及可视化铝胁迫下植物细胞和斑马鱼中的硫化氢动态。这些发现为使用PFBS合成硫化氢靶向分子提供了新选择，并证明了Fl-F-Me作为从实验室到实际应用中的潜在硫化氢传感器。

Fl-F-Me的合成

Fl-F-Me是根据已有文献中的程序[46]、[47]、[48]对化合物2进行 slight modifications 合成的。将化合物3（34.1毫克，0.10毫摩尔）溶解在二氯甲烷中，与三乙胺（Et₃N）（19.94毫克，0.20毫摩尔）混合，在室温下搅拌0.5小时。当混合物的颜色从黄色变为橙黄色后，迅速加入PFBS氯化物（PFBSCl）（39.4毫克，0.15毫摩尔），并在室温下反应5小时（图S1）。通过

Fl-F-Me的合成与表征

Fl-F-Me由荧光团Fl-Me和用于硫化氢识别的PFBS单元组成，通过三个关键步骤合成（图S1）。前两个步骤制备了第三步的关键前体化合物3，最终得到产品Fl-F-Me。首先，在K₂CO₃的存在下，化合物1的酚羟基通过亲核取代反应与碘甲烷发生O-烷基化，生成二甲基化产物1。化合物1的结构已完全表征

结论

我们开发了一种新型的光促激活荧光探针Fl-F-Me，用于特异性检测硫化氢。通过单晶X射线衍射验证，Fl-F-Me与许多基于传统荧光素的分子不同。它以α-羟基荧光素衍生物作为荧光团，并采用通常用于过氧化氢（H₂O₂识别的PFBS单元作为特定的硫化氢响应单元。这种方法补充了现有的硫化氢检测方法

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家铁路集团医疗与健康专项研究计划（J2023Z616）和中国国家自然科学基金（82474333）的支持。我们还要感谢中国北京首都医科大学核心设施中心的赵焕英女士和傅文卓先生。