《Journal of Fungi》：Biomarkers in the Diagnosis of Aspergillosis
Laura Rivera-Agudelo,
Diego H. Cáceres,
Julián C. Arango-Rincón,
Julio C. Jaramillo-Alzate,
Alejandra Zuluaga-Rodriguez and
álvaro L. Rúa-Giraldo
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这篇综述系统阐述了生物标志物在曲霉病诊断中的关键作用，包括细胞壁组分、遗传序列和代谢产物三大类。文章详细分析了半乳甘露聚糖（GM）、1,3-β-D-葡聚糖（BDG）、抗体检测及分子诊断等方法的性能、优势与局限，并强调了联合检测策略在侵袭性肺曲霉病（IPA）、过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）及慢性肺曲霉病（CPA）等不同临床形式中的应用价值，旨在推动更精准、快速的临床诊断。
曲霉病（Aspergillosis）是一组由曲霉属（Aspergillus）真菌引起的、影响肺部及其他器官的侵袭性与非侵袭性疾病。随着抗真菌药物耐药菌株的不断出现，采取包括生物标志物检测在内的联合诊断方法，对实现准确、及时的诊断至关重要。本综述旨在系统阐述各类生物标志物及其在曲霉病诊断中的用途，为临床实践提供参考。
曲霉属与临床疾病谱
曲霉是普遍存在的腐生丝状真菌，主要通过吸入环境中循环的分生孢子而感染。在免疫正常个体中，孢子可被肺巨噬细胞、中性粒细胞及补体系统等先天机制清除。而在因基础疾病或免疫抑制治疗导致免疫受损的个体中，则无法控制感染。其中，长期且严重的中性粒细胞减少是发展为曲霉病的主要风险因素。
肺曲霉病主要分为侵袭性和非侵袭性疾病，包括过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）、慢性肺曲霉病（CPA）和侵袭性肺曲霉病（IA）。ABPA是由曲霉抗原诱导的I型超敏反应性疾病，主要影响特应性个体，尤其是有哮喘或囊性纤维化的患者。CPA是一组进行性、非侵袭性真菌病，可影响免疫功能正常或轻度免疫抑制的患者，常与肺气肿、慢性阻塞性肺疾病（COPD）或结核后遗症等已有肺部疾病相关。而IA是最严重的临床表现，与化疗、皮质类固醇治疗导致的中性粒细胞减少、HIV感染及先天性免疫缺陷有关，死亡率高达40%至50%。
生物标志物的分类与应用
目前用于曲霉病诊断的主要生物标志物可分为三类：细胞膜成分、特异性DNA序列和代谢产物。
抗曲霉抗体检测
在CPA和ABPA中，患者通常能有效产生抗体，因此抗体类生物标志物具有重要诊断价值。可用的检测包括沉淀素试验以及IgG、IgA、IgM和IgE水平的检测。其中，IgG的诊断性能最佳。在ABPA中，其特征是由于I型和III型超敏反应导致的曲霉特异性IgE和IgG水平升高，这些标志物被用于其诊断。
半乳甘露聚糖（GM）
GM是研究最广泛的生物标志物，尤其在血液系统恶性肿瘤患者中。它是一种在真菌生长（血管侵袭）过程中释放的细胞壁多糖成分，在血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）等体液中的水平与真菌负荷和活动性感染相关。其检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、侧向流动试验（LFA）和化学发光免疫分析。多项研究评估了GM检测在IA中的诊断性能，报告灵敏度在48%至90%之间，特异性在80%至100%之间，其分析性能取决于样本类型、患者群体和基础疾病。例如，在COVID-19相关肺曲霉病（CAPA）中，血清样本阳性率约为20%，而呼吸道样本阳性率超过80%。不过，GM检测可能出现假阳性结果，原因包括患者相关因素（如菌血症、多发性骨髓瘤、透析、高纤维饮食）或与其他真菌属（如荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、镰刀菌属）GM表位的交叉反应。
甘露蛋白
甘露蛋白是许多结构蛋白被甘露糖基化的糖缀合物，与GM一样，在真菌活跃生长时释放。已有基于LFA的商业检测方法。在BAL样本中，该检测的灵敏度接近70%，特异性为100%。一项荟萃分析得出结论，该检测在BAL样本中的诊断性能优于血清样本，灵敏度为86%，特异性为93%。与GM类似，已报道与青霉属、荚膜组织胞浆菌和尖孢镰刀菌存在交叉反应。
1,3-β-D-葡聚糖（BDG）
BDG是一种由葡萄糖单体通过β-(1,3)键连接而成的线性多糖，是维持细胞壁结构完整性的重要组成部分，并作为其他聚合物的锚定点。其体外检测利用了该抗原通过与鲎（Limulus spp.）的因子G相互作用激活凝血级联反应的能力。值得注意的是，该抗原并非单一属或种特异，因为它由曲霉属、念珠菌属、肺孢子菌属、组织胞浆菌属和球孢子菌属等产生。在曲霉病中，其灵敏度记录为大于60%，报告灵敏度和特异性范围分别为67%至100%和50%至100%。BDG检测的假阳性结果可能源于使用纤维素膜进行血液透析、通过过滤器输注血液制品、链球菌属或革兰阴性杆菌引起的菌血症、与棉纱布的组织接触以及使用阿莫西林-克拉维酸和哌拉西林-他唑巴坦等抗生素。
DNA序列检测
曲霉属物种的基因组大小约为28-40 Mb。常见的分子诊断靶点包括核糖体18S和28S基因以及内部转录间隔区（ITS）。聚合酶链式反应（PCR）已广泛用作曲霉病，特别是IA的诊断方法，并被EORTC/MSG指南采纳为诊断可能IA的微生物学标准。商业PCR试剂盒的开发有助于检测标准化，在BAL和其他呼吸道样本中，其灵敏度可达80-94%，特异性为97-99%。此外，还开发了能够检测烟曲霉cyp51A基因中唑类耐药标记的PCR检测。值得注意的是，PCR在血液或血清中单独使用不能确认IA诊断，且在接受预防性或经验性抗真菌治疗的患者中，由于可能将真菌负荷降至检测限以下，通常不推荐使用此检测。
代谢衍生物
三乙酰基夫沙宁C（TAFC）
TAFC是烟曲霉和构巢曲霉的主要铁载体，是IA潜在的早期诊断生物标志物，因为它仅在真菌活跃生长时分泌，不存在于分生孢子中。其检测依赖于高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳-电喷雾电离-质谱（CE-ESI-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS/MS）等方法。在血液系统恶性肿瘤患者的尿液样本中使用CE-ESI-MS检测，其灵敏度为81%，特异性为90%。
挥发性有机化合物（VOCs）
由曲霉诱导的挥发性有机化合物（VOCs）是代谢过程的副产物，可以从血液、唾液、呼出气和尿液等多种样本中获得。其中，2-戊基呋喃（2PF）与曲霉病相关。由于这些化合物可被呼出，因此有潜力在曲霉病患者的呼吸中被轻易检测到，这使其成为一种有吸引力的方法。目前，一些使用该技术的研究报告灵敏度约为80%至100%。
生物标志物的互补性
多项研究报告称，联合使用生物标志物可显著提高诊断灵敏度/或特异性。在感染早期阶段联合使用GM和BDG备受关注；一项研究报告称，在血液病患者中应用这种联合检测，灵敏度从60%提高到了83%。GM水平检测与曲霉序列拷贝数检测的结合被描述为IA诊断的最佳生物标志物组合策略，因为它提高了灵敏度，尤其是在发生流感相关肺曲霉病（IAPA）或COVID-19相关肺曲霉病（CAPA）的患者中。其他组合也已被评估，例如在BAL中检测GM和TAFC，可将灵敏度从73%提高到87%。
结论
使用非培养方法检测生物标志物是近几十年来医学真菌学领域最重要的创新之一。生物标志物为非侵入性、快速、准确的诊断提供了支持，为真菌疾病的管理开辟了新途径。具有潜在诊断价值的循环分子的识别及其后续应用仍存在一些待解决的挑战。然而，对曲霉属物种生物学、基因组学、蛋白质组学和转录组学理解的最新进展，已使得识别更多潜在生物标志物成为可能，这将支持新诊断方法的设计。
