《Animals and Zoonoses》：Combined application of carbon dots and miRNA-21-5p promotes the resistance of mice to Actinobacillus pleuropneumoniae infection by inhibiting macrophage pyroptosis
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细菌性肺炎对畜牧业的 здоровое发展和公共卫生安全构成重大威胁。细菌耐药性的日益普遍加剧了该疾病防治的挑战，亟需开发新型治疗策略。由抗坏血酸和聚乙烯亚胺合成的碳点（CDots）以及源自猪气管上皮细胞的 miR-21-5p 已被证实可单独对肺部细菌感染发挥
细菌性肺炎对畜牧业的 здоровое发展和公共卫生安全构成重大威胁。细菌耐药性的日益普遍加剧了该疾病防治的挑战，亟需开发新型治疗策略。由抗坏血酸和聚乙烯亚胺合成的碳点（CDots）以及源自猪气管上皮细胞的 miR-21-5p 已被证实可单独对肺部细菌感染发挥保护作用。然而，二者的联合治疗效果及其潜在机制尚不清楚。在此，研究人员建立了胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染的肺泡巨噬细胞体外感染模型，APP 是一种引起典型胸膜炎和肺炎的病原体，常用于细菌性肺炎研究。研究发现，CDots 和 miR-21-5p 处理增强了肺泡巨噬细胞对 APP 的吞噬和杀菌活性，同时抑制了 APP 诱导的这些细胞焦亡。机制上，APP 感染激活了 PI3K/AKT 信号通路，而 CDots 和 miR-21-5p 阻断了这一激活，从而减轻了 APP 感染触发的巨噬细胞焦亡。此外，在感染 APP 或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的小鼠模型中，CDots 和 miR-21-5p 的单药及联合治疗均显著降低了死亡率、体重减轻、临床评分及肺组织病理损伤。值得注意的是，联合治疗表现出最显著的治疗效果。此外，该联合策略降低了 APP 感染小鼠肺组织中促炎因子 IL-6 和 IL-1β的表达，并减轻了中性粒细胞浸润。因此，研究表明联合给药 CDots 和 miR-21-5p 通过抑制 PI3K/AKT 信号通路介导的巨噬细胞焦亡，增强了小鼠对 APP 感染的抵抗力，为 APP 及其他细菌性肺炎的防治提供了新策略。
**论文解读：碳点与 miRNA-21-5p 联用抗细菌性肺炎的新策略**
细菌性肺炎是严重威胁人类与动物健康及生命的呼吸系统疾病，其主要防控手段仍依赖抗生素和疫苗。然而，细菌耐药性的上升、广谱交叉保护性疫苗的缺乏、病原体范围的扩大以及混合感染的频发，使得现有疗法面临严峻挑战。因此，探索包括增强宿主抗感染免疫反应在内的新型治疗策略至关重要。微 RNA（miRNA）作为一类非编码单链 RNA 分子，可通过转录后水平调控基因表达，参与细胞分化、代谢及死亡等过程。先期研究表明，源自猪气管上皮细胞外泌体的 miR-21-5p 可通过靶向 PI3K 信号通路关键分子 PIK3CD 抑制焦亡并促进自噬，从而缓解炎症并清除胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染。碳点（CDots）作为一种新型碳基纳米材料，具有优异的荧光性、光稳定性、生物相容性及低毒性，虽已证实对多种耐药菌有抗菌潜力，但其调控宿主免疫细胞抗感染的具体机制尚待阐明。鉴于 APP 能诱导典型的肺部纤维化及出血性病变，且其免疫病理特征与人肺炎相似，常被用作研究模型。本研究旨在深入探讨 CDots 与 miR-21-5p 联合治疗的疗效及机制，以期为细菌性肺炎防治提供新思路。该研究成果发表于《Animals and Zoonoses》。
为开展此项研究，研究人员选用了 APP 血清 5 型参考株 L20 及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA-USA300）作为病原模型，利用永生化猪肺泡巨噬细胞（PAMs）构建体外感染模型，并采用 SPF 级 ICR 小鼠建立体内感染模型。关键技术方法包括：利用抗坏血酸和聚乙烯亚胺通过水热法合成 CDots；通过转染技术将 miR-21-5p 或其对照物导入细胞；采用平板计数法检测巨噬细胞吞噬及杀菌能力；利用 Western blot 技术检测 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白及焦亡关键蛋白（如 cleaved-GSDMD、cleaved-caspase-1）的表达水平；通过流式细胞术分析细胞死亡形式及肺组织免疫细胞亚群变化；借助 RT-qPCR 检测炎症因子 mRNA 水平；并通过小鼠生存率、体重变化、临床评分、肺部细菌载量测定及组织病理学染色（H&E）综合评价体内疗效。
**研究结果**
**3.1 联合给药增强巨噬细胞吞噬与杀菌效应**
研究人员通过体外感染模型发现，在感染后 1 小时，CDots 单药组及联合用药组均显著提升了 PAMs 对 APP 的吞噬活性，而 miR-21-5p 单药组无显著差异。至感染后 5 小时，各治疗组胞内细菌负荷均显著降低，其中联合治疗组效果最为显著，表明二者联用能有效协同增强 PAMs 的杀菌能力。
**3.2 联合给药抑制 APP 诱导的 PAMs 焦亡**
实验结果显示，APP 感染导致 PAMs 大量死亡，而 CDots 或 miR-21-5p 单独或联合处理均显著降低了细胞死亡率，且联合组保护作用最强。进一步分析表明，APP 感染显著上调焦亡标志蛋白 cleaved-GSDMD 和 cleaved-caspase-1 的表达，联合治疗对此具有最强的抑制作用，证实二者协同抑制了 APP 诱导的 PAMs 焦亡。
**3.3 联合给药通过抑制 PI3K/AKT 通路减轻焦亡**
机制研究表明，APP 感染激活了 PI3K/AKT 信号通路（表现为 p-PI3K 和 p-AKT 水平升高）。使用 PI3K 通路激活剂 740Y-P 可逆转 CDots 和 miR-21-5p 对焦亡的抑制作用，而敲低 PIK3CD 则模拟了治疗效果。结果证实，联合用药通过显著降低 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白水平，阻断 PI3K/AKT 通路激活，从而减轻 APP 诱导的 PAMs 焦亡。
**3.4 联合给药增强小鼠对 APP 感染的抵抗力**
在小鼠体内实验中，尾静脉注射 miR-21-5p 质粒 48 小时后，肺组织中 miR-21-5p 表达显著升高。生存分析显示，联合治疗组小鼠死亡率最低，且能显著改善临床症状、缓解体重下降、降低肺部细菌载量并减轻肺水肿及出血性坏死。病理切片显示，联合治疗最有效缓解了肺泡壁增厚、中性粒细胞浸润及炎性渗出。该结论在 MRSA 感染模型中也得到验证。
**3.5 联合给药减少肺部中性粒细胞比例及炎性因子表达**
流式细胞术及 RT-qPCR 结果显示，联合治疗显著降低了 APP 感染小鼠肺组织中的中性粒细胞比例，同时提高了 CD4?和 CD8?T 细胞比例。此外，联合治疗最显著地降低了促炎因子 IL-1β和 IL-6 的表达水平，表明其通过调节免疫细胞构成和抑制炎症反应减轻了肺损伤。
**讨论与结论**
本研究证实，由抗坏血酸和聚乙烯亚胺合成的 CDots 与 miR-21-5p 联合应用，能通过抑制 PI3K/AKT 信号通路的激活，有效阻断 APP 感染引发的肺泡巨噬细胞焦亡。这种协同作用不仅增强了巨噬细胞的吞噬杀菌功能，还显著减轻了小鼠肺部的炎症浸润和组织损伤，提高了宿主对 APP 及 MRSA 等呼吸道细菌感染的抵抗力。相较于单一疗法，联合策略展现出更优的治疗效果。该研究揭示了一种高效、生物相容性好、无毒且非抗生素依赖的细菌性肺炎治疗新策略，为应对细菌耐药性挑战提供了重要的理论依据和潜在的治疗方案。
