《European Biophysics Journal》：Indenting multicellular spheroids with various tip geometries
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为探究AFM针尖几何结构对三维细胞球体杨氏模量测量的影响，研究人员使用不同形状（球形、金字塔形、无尖端）的AFM探针，对四种细胞系（A549、NHLF、HT-29、CCD-18Co）形成的球体进行了纳米压痕研究。结果显示，使用不同接触几何结构拟合会得到显著不同的杨氏模量值，突显了这些复杂细胞系统的多尺度响应特性，以及实验设计和AFM探针选择的重要性。研究还观察到F-肌动蛋白丝的位置与球体刚度相关。
在癌症研究与组织工程领域，三维多细胞球体因其能部分模拟肿瘤微环境而备受关注，成为研究细胞与微环境相互作用的重要体外模型。肿瘤等生物组织的力学特性，如其刚性或柔韧性，深刻影响着细胞行为、信号传导乃至疾病进程。因此，精确测量球体的力学性质，对于理解肿瘤发展、药物筛选乃至组织构建都至关重要。目前，原子力显微镜（AFM）是研究生物样品力学特性的强大工具。然而，一个长期存在的挑战是：AFM测量中使用的针尖形状和尺寸各不相同，从尖锐的金字塔形到圆滑的球形，再到宽大的无尖端悬臂梁，它们与样品的接触几何形状迥异。这引出一个核心问题：当使用不同几何形状的针尖去“触摸”一个结构复杂的多细胞球体时，测得的力学性质（如杨氏模量）会如何变化？这种差异是单纯的测量误差，还是反映了球体内部从单细胞到细胞团簇不同层次结构的真实力学响应？这一问题对于确保实验结果的可比性与可靠性，以及正确解读生物学意义至关重要。
为了回答这个问题，一组研究人员在《European Biophysics Journal》上发表了一项系统性的研究。他们旨在探究AFM针尖几何形状对源自四种不同细胞系（人肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞NHLF、人结肠癌细胞HT-29和人结肠成纤维细胞CCD-18Co）的多细胞球体力学表征的影响，并试图将力学测量结果与细胞内部的骨架结构联系起来。
研究主要采用了以下关键技术方法：首先，研究人员在低吸附U型底96孔板中培养了四种细胞系的三维球体模型。其次，利用共聚焦显微镜对球体内部的F-肌动蛋白丝进行成像，以观察不同细胞系球体中细胞骨架的组织差异。核心实验技术是原子力显微镜（AFM）纳米压痕技术，他们使用了四种不同几何形状的探针：半径为5微米（CP5）和10微米（CP10）的球形胶体探针、金字塔形探针（MLCT）以及无尖端悬臂梁（TL），对球体进行力学性能测量。最后，通过相应的接触力学模型（如赫兹模型）对获得的力-压痕曲线进行拟合，以计算出球体的表观杨氏模量。
研究结果如下：
组织学观察揭示细胞骨架差异
通过共聚焦显微镜观察发现，不同细胞系形成的球体内部F-肌动蛋白的分布存在明显差异。肺癌A549细胞球体和结肠癌细胞HT-29、结肠成纤维细胞CCD-18Co球体中的细胞多呈圆形，肌动蛋白丝主要分布在细胞周边。而肺成纤维细胞NHLF形成的球体则由纺锤形细胞构成，细胞内可见粗大的肌动蛋白束贯穿整个细胞体。这种细胞骨架组织形态的差异为后续的力学差异提供了结构基础。
不同针尖几何形状测得迥异的杨氏模量
研究人员系统比较了使用不同AFM针尖获得的数据：
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球形探针（CP）：使用半径5微米和10微米的球形探针时，测得肺成纤维细胞NHLF球体的杨氏模量显著高于肺癌A549球体。然而，对于两种结肠细胞系（HT-29和CCD-18Co）的球体，无论使用哪种尺寸的球形探针，测得的杨氏模量均无显著差异。
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金字塔形探针：使用尖锐的金字塔形针尖时，所有类型球体测得的杨氏模量值均高于使用球形探针测得的值。同样，NHLF球体比A549球体更硬，而两种结肠细胞球体之间仍无显著差异。研究还发现，在金字塔形针尖测量中，改变压入深度（通过调节载荷力实现）并未对同一球体的杨氏模量值产生显著影响，表明在针尖可及的压入范围内，球体外层区域的力学性质相对均一。
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无尖端悬臂梁（TL）：使用宽大的无尖端悬臂梁时，测得的杨氏模量值远低于前两种针尖。这种探针与球体的接触面积最大，反映的是球体整体或“体积平均”的力学响应。数据分析表明，将球体视为被刚性平板压入的柔软球体（赫兹球-平面模型）是最合适的解释模型。在此尺度上，NHLF球体依然比A549球体更硬，而两种结肠细胞球体的杨氏模量仍然相近。
针尖形状决定探测的力学尺度
一个关键的发现是，针尖的几何形状直接决定了探测的“尺度”。尖锐的金字塔形针尖接触面积小，产生高局部应力，主要敏感于球体最外层细胞的皮层刚度，特别是致密的皮质肌动蛋白网络。因此，测得的杨氏模量值最高。较小的球形探针（如CP5）增大了接触面积，能探测到几个细胞及其细胞外基质的综合响应。更大的球形探针（CP10）和无尖端悬臂梁则进一步平均化了更大体积内的力学响应，包含了更多细胞-细胞相互作用和可能的内部结构的影响，因此测得的杨氏模量值最低。这明确表明，使用不同接触几何形状进行拟合会得到显著不同的杨氏模量值，凸显了这些复杂细胞系统的多尺度力学响应特性。
细胞骨架组织与球体刚度的关联
综合所有测量结果，研究观察到一个清晰的模式：无论使用何种类型的针尖，由肺成纤维细胞（NHLF）形成的、具有贯穿整个细胞体的厚实肌动蛋白束的球体，其杨氏模量始终高于由圆形细胞（A549、HT-29、CCD-18Co）形成的、肌动蛋白主要分布在周边的球体。这表明，即使在球体水平，细胞的力学性质也与其细胞骨架的组织方式密切相关。然而，这一关联性存在细胞类型特异性。在肺细胞中，癌变（A549）与正常（NHLF）状态伴随着细胞骨架组织的显著差异和相应的刚度变化。但在结肠细胞中，癌细胞（HT-29）与正常成纤维细胞（CCD-18Co）的球体在细胞骨架形态和力学刚度上均未表现出差异。研究人员推测，这可能是因为在三维球体这种微环境中，细胞感知到的整体微环境刚度（由周围其他细胞构成）可能更为关键。对于相对柔软的结肠细胞球体，无论细胞本身是癌变还是正常，可能都未触发显著的肌动蛋白重塑，从而导致相似的力学表现。
结论与讨论
本研究系统揭示了AFM针尖几何形状对多细胞球体力学表征的深刻影响。研究表明，测得的杨氏模量并非一个绝对的、单一的材料常数，而是一个与探针-样品接触几何密切相关的“表观”值。尖锐针尖探测局部、表面的细胞皮层力学，反映单细胞层次的特性；而大接触面积的探针则探测球体整体或大体积平均的力学响应，包含了细胞集体行为和细胞外基质的贡献。因此，AFM针尖的选择决定了研究者是从“微观”还是“宏观”尺度来解读球体的力学性质。
这项研究的重要意义在于：
首先，它强调了在利用AFM研究三维细胞聚集体等复杂生物系统时，精确实验设计和探针选择的重要性。不同的研究目的（探测单细胞刚度 vs. 探测组织整体力学）应匹配不同的针尖几何形状。忽视这一点可能导致数据误读和不同研究之间的不可比性。
其次，研究证实了即使在多细胞层级，细胞的力学特性仍与其细胞骨架组织密切相关，但同时也指出了这种关联可能受到细胞类型和三维微环境背景的调控。这为了解肿瘤等组织中力学异质性的来源提供了新视角。
最后，该工作为未来基于球体模型的标准化生物力学测量提供了重要参考。它提示，在报告球体力学数据时，必须详细说明所使用的AFM探针几何形状、压入深度和拟合模型，以确保结果的可重复性和科学价值。通过阐明针尖几何形状如何“过滤”和“呈现”不同尺度下的力学信息，本研究为更精确、更有目的地利用AFM探索生命系统的复杂力学世界奠定了方法论基础。
