多酚-雷帕霉素(rapamycin, RAPA)自组装纳米粒通过调节巨噬细胞线粒体稳态与极化重编程治疗炎症性疾病

《Materials & Design》：Polyphenol-rapamycin self-assembled nanoparticles for inflammatory diseases treatment by regulating macrophage mitochondrial homeostasis and polarization reprogramming

　　

炎症性疾病构成严重的全球健康负担，占全球死亡人数50%以上。大量证据表明巨噬细胞稳态失衡是关键致病驱动因素，涉及一条重要的病理级联反应：巨噬细胞内过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄积诱导线粒体损伤，进而引起M1/M2极化失调，最终加剧炎症进展。然而，现有手段难以同时解决上述问题。本研究设计了一种线粒体靶向的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)-雷帕霉素(rapamycin, RAPA)自组装纳米粒(EGCG-RAPA nanoparticles, ER NPs)，以克服单功能治疗平台的局限性。体外研究表明，ER NPs能有效清除胞内及线粒体内ROS，恢复细胞氧化还原平衡；同时恢复线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)并提高ATP生物合成，重建线粒体稳态；此外，ER NPs通过调控巨噬细胞向保护性M2型极化，重塑稳定的抗炎免疫微环境。在体内牙周炎小鼠模型、糖尿病皮肤创面小鼠模型及脓毒症(sepsis)小鼠模型中，与游离RAPA相比，ER NPs显示出显著更优的抗炎活性，有效减轻过度炎症引起的组织损伤。综上，该线粒体靶向多功能自组装纳米系统直接作用于巨噬细胞稳态失衡的核心病理级联，为炎症性疾病提供了一种有前景的治疗策略。

论文解读：多酚-雷帕霉素自组装纳米粒通过调节巨噬细胞线粒体稳态与极化重编程治疗炎症性疾病

本文由Meitong Liu、Zhiyan Zhou、Zhibang Li、Hao Chen、Jing Sun、Shaohua Ge、Baojin Ma及Yang Yu（山东大学口腔医学院/附属口腔医院牙周科等机构）撰写，发表于《Materials》。

研究背景与意义

炎症性疾病是全球发病与死亡的主要原因，超过50%的死亡与之相关。其核心病理机制涉及巨噬细胞内过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄积导致线粒体功能障碍（线粒体膜电位mitochondrial membrane potential, MMP下降、ATP合成减少、线粒体ROS即mtROS累积），进而促使巨噬细胞向促炎M1型极化并抑制抗炎M2型极化，形成"氧化应激—线粒体损伤—免疫失衡"的恶性循环。现有常规抗炎药（糖皮质激素、非甾体抗炎药）存在全身毒性，单一天然产物疗效有限，而FDA批准的mTOR（mammalian target of rapamycin）抑制剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)虽具调节线粒体功能和巨噬细胞代谢潜力，却受限于水溶性差、稳定性低及ROS干扰其结合靶点导致药效减弱。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)作为绿茶多酚具有抗氧化及线粒体亲和性，但同样存在化学不稳定、生物利用度低的问题。因此，研究人员通过非共价相互作用构建EGCG与RAPA的自组装纳米粒(EGCG-RAPA nanoparticles, ER NPs)，以期协同实现ROS清除、线粒体保护与巨噬细胞极化重编程的多维调控。

主要关键技术方法

研究人员采用甲醛介导EGCG预聚合并与RAPA通过π-π堆积和氢键自组装制备ER NPs；通过扫描/透射电镜(SEM/TEM)、动态光散射(DLS)、X射线光电子能谱(XPS)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)进行理化表征；采用DPPH、超氧阴离子(O₂^•?)、羟基自由基(•OH)清除实验评价体外抗氧化能力；以CCK-8法、活/死染色、溶血实验评估生物相容性；通过罗丹明B标记、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞摄取及线粒体共定位；用DCFH-DA探针、流式细胞术及H₂O₂含量试剂盒检测胞内ROS，RT-qPCR检测抗氧化基因CAT和NQO1表达；用JC-1、MitoSOX、线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)试剂盒、线粒体钙荧光探针Rhod-2 AM及ATP发光法评估线粒体功能；以LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，通过免疫荧光(immunofluorescence, IF)及RT-qPCR检测M1标志物(iNOS、CD86)和M2标志物(Arg-1、IL-10、CD206)评估巨噬细胞极化调控；建立小鼠结扎诱导牙周炎模型（局部给药）、链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导糖尿病全层背部皮肤创面模型（局部给药）及脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导脓毒症模型（腹腔注射），分别通过Micro-CT、组织学(H&E、Masson、TRAP染色)、免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、IF染色及生存曲线评估体内疗效。

研究结果

3.1. Characterization of ER NPs

通过SEM、TEM观察到ER NPs呈球形，平均水合粒径约391 nm，多分散指数(polydispersity index, PDI)为0.114，Zeta电位为?26.76 mV；在PBS、水及含血清培养基中72 h粒径稳定。元素映射证实C、O、N均匀分布，XPS检测到RAPA特征N峰，计算RAPA负载量约32%；FT-IR显示EGCG与甲醛发生加成反应形成醚键并与RAPA通过非共价作用组装，EGCG骨架保留；XRD显示ER NPs为无定形结构。自由基清除实验表明ER NPs对O₂^•?、DPPH及•OH具有浓度依赖性清除能力。结论：ER NPs成功制备，具良好分散稳定性、适宜尺寸及强抗氧化活性。

3.2. Biocompatibility, mitochondrial-targeted, and antioxidant ability of ER NPs

CCK-8及活/死染色显示≤10 μg/mL ER NPs对RAW264.7、人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts, HFFs)、人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGFs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)无明显细胞毒性，且有轻微促增殖作用；溶血率<3%（≤100 μg/mL）。CLSM显示Rhodamine B标记ER NPs时间依赖性被RAW264.7内化，且与Mito-Tracker Green标记的线粒体共定位，证实线粒体靶向性。H₂O₂刺激后，ER NPs显著降低DCFH-DA荧光强度及胞内H₂O₂含量，流式细胞术显示ROS降至正常水平13.6%；上调H₂O₂抑制的抗氧化酶基因CAT和NQO1 mRNA表达。结论：ER NPs在安全工作浓度下具备良好生物相容性、线粒体靶向性及胞内ROS清除与氧化还原平衡恢复能力。

3.3. Mitochondrial protection of ER NPs

H₂O₂诱导Raw264.7后，ER NPs显著降低MitoSOX标记的mtROS荧光；JC-1检测显示ER NPs恢复红/绿荧光比值（Aggregates/Monomers），逆转线粒体去极化；恢复ATP水平至正常；Mito-Tracker Red显示ER NPs减轻线粒体片段化、恢复网状结构；抑制过度MPTP开放（Calcein AM荧光增强）并降低异常升高的线粒体Ca²⁺（Rhod-2 AM荧光减弱）。结论：ER NPs通过清除mtROS、恢复MMP、抑制MPTP异常开放及钙超载，保护线粒体形态与功能，重建线粒体稳态。

3.4. Anti-Inflammatory and immune modulation Capabilities of ER NPs

LPS刺激RAW264.7后，ER NPs下调M1标志物CD86、iNOS的蛋白荧光强度及iNOS mRNA表达；上调M2标志物Arg-1、IL-10的蛋白荧光强度及IL-10 mRNA表达。结论：ER NPs抑制促炎M1极化并促进抗炎M2型极化，重塑免疫微环境。

3.5. Anti-inflammatory therapeutic activity of ER NPs in periodontitis model

结扎法建立小鼠牙周炎模型，局部给予ER NPs每3天一次共14天。Micro-CT显示ER NPs显著减小CEJ（cementoenamel junction，釉牙骨质界）-ABC（alveolar bone crest，牙槽骨嵴顶）距离，抑制牙槽骨吸收；H&E及Masson染色显示减轻骨破坏、促进胶原沉积；TRAP染色显示破骨细胞活性受抑；IHC显示下调促炎因子IL-1β、上调抗炎因子IL-10；IF显示下调CD86⁺M1巨噬细胞、上调CD206⁺M2巨噬细胞。结论：局部应用ER NPs通过调节巨噬细胞M1/M2极化平衡、抑制过度炎症，有效缓解牙周炎骨丧失与组织损伤。

3.6. ER NPs accelerate diabetic full-thickness back skin wound healing

STZ诱导糖尿病小鼠全层背部皮肤缺损模型，局部给予ER NPs。ER NPs组创面闭合率最高，第12天几近完全愈合；H&E显示再上皮化良好，Masson显示胶原排列致密；IF显示线粒体生物发生调控因子PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha）表达上调；IHC显示IL-1β↓、IL-10↑；IF显示CD86⁺M1↓、CD206⁺M2↑。结论：ER NPs通过增强线粒体生物发生、抑制炎症及重编程巨噬细胞极化，加速糖尿病难愈创面修复。

3.7. Therapeutic effects of ER NPs in the sepsis model

LPS腹腔注射诱导脓毒症模型，腹腔注射ER NPs。ER NPs组5天生存率（71%）显著高于PBS组（14%）及游离RAPA组（42%）；体重下降幅度小且恢复早，临床评分低；外周血白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NE)、血小板(PLT)计数回升；血清IL-6、IL-1β水平显著降低；体内成像显示ER NPs在败血症小鼠肝、肾、心、肺富集增加，脾脏F4/80⁺巨噬细胞中PGC-1α上调。结论：系统性给予ER NPs可减轻脓毒症细胞因子风暴、改善免疫抑制状态、上调巨噬线粒体功能相关蛋白，提高存活率。

讨论与结论总结

研究人员成功通过多酚驱动的非共价自组装构建了线粒体靶向ER NPs，EGCG提供抗氧化活性及线粒体靶向性，RAPA贡献线粒体功能调节与免疫调控，二者协同打破氧化应激—线粒体损伤—免疫失衡恶性循环。ER NPs在三种代表性炎症动物模型（局部慢性炎症—牙周炎、高糖慢性创面—糖尿病皮肤伤口、全身急性炎症—脓毒症）中均展现出优于游离RAPA的抗炎及组织保护作用。该研究证明多酚-药物自组装纳米策略可整合多重功能于一体，为以巨噬细胞线粒体稳态和极化失衡为核心的炎症性疾病提供了新型治疗平台。

论文结论部分原文翻译：综上所述，研究人员通过多酚驱动自组装成功构建了线粒体靶向ER NPs，其中EGCG通过非共价相互作用结合RAPA。ER NPs整合了EGCG的抗氧化与抗炎特性及RAPA的线粒体与免疫调节功能，从而抑制炎症进展。其强抗氧化与线粒体靶向能力使ER NPs能高效清除胞内ROS及mtROS；此外，通过增强抗氧化酶活性，ER NPs打断氧化应激恶性循环并恢复细胞氧化还原平衡。ER NPs还可恢复MMP、抑制MPTP过度开放并恢复正常线粒体形态，实现全面的线粒体功能重塑。而且，ER NPs通过调节巨噬细胞极化及炎性介质水平恢复免疫稳态。体内疗效经牙周炎（局部慢性炎症）、糖尿病皮肤创面（高糖条件下的特殊慢性炎症）及脓毒症（全身急性炎症）小鼠模型验证，结果表明ER NPs显著减轻炎症并促进组织修复。在局限慢性炎症如牙周炎中，局部给药可靶向调节炎症微环境与巨噬细胞极化，同时最小化全身暴露，从而促进组织再生；在糖尿病慢性创面等复杂高糖介导的炎症微环境中，ER NPs协同调控氧化应激、线粒体功能障碍及巨噬细胞极化，同时应对多种病理因素，克服了单一功能机制传统疗法的局限；在脓毒症等全身急性炎症中，腹腔注射系统给药可减轻炎症风暴并在巨噬细胞中调节线粒体稳态以改善免疫失衡。综上，ER NPs在由氧化应激介导的线粒体功能障碍及巨噬细胞极化失衡驱动的炎症性疾病中展现出更大的治疗潜力。尽管目前体内实验主要验证了线粒体功能、巨噬细胞极化及抗炎疗效，未来将进一步明确体内ROS清除及其他治疗机制，阐明氧化应激、线粒体功能障碍与免疫失衡间的内在联系及相关下游通路，为ER NPs在炎症性疾病中的应用提供更全面机制依据。总体而言，该线粒体靶向多酚–RAPA纳米系统代表了炎症性疾病一种有前景的治疗策略。