综述：用于探测自由基生物学的纳米金刚石量子传感器

《Advanced Functional Materials》：Nanodiamond Quantum Sensors for Probing Free Radical Biology

　　

自由基在细胞信号传导和疾病发生中扮演核心角色，但其寿命短、稳态浓度低且空间异质性强，导致在活体系统中难以被直接检测。传统方法包括发光探针和电子自旋共振（ESR）光谱，虽提供了重要见解，但本质上受限于化学扰动、间接读出、系综平均或空间分辨率不足。含氮空位（NV）中心的纳米金刚石（NDs）提供了一种基于量子的全新传感策略。通过利用T1弛豫测量技术，NV中心能够直接探测由未成对电子引起的局部磁噪声变化，从而在生理条件下实现对自由基生成环境的无标记、非破坏性近距离测量。虽然T1弛豫测量不能直接识别单个自由基物种，但它能提供局部顺磁环境的空间局域化读出，从而补充现有的自由基检测方法。得益于其卓越的光稳定性、化学惰性和生物相容性，纳米金刚石特别适用于单细胞和亚细胞水平的纵向测量。本综述将纳米金刚石量子传感置于自由基检测技术的广阔图景中，系统比较了传统方法，并强调了其局限性如何推动了基于NV传感器的应用。文中讨论了纳米金刚石在活体系统中实现自由基传感的最新进展，指出了包括测量伪影、纳米金刚石异质性、表面及环境依赖的信号调制以及基于T1读出的有限化学特异性等关键挑战，并展望了其在复杂生物模型中的未来机遇。综上所述，这些进展确立了纳米金刚石作为一个强大且有前景的功能材料平台，用于探测活体系统中的氧化还原活性微环境和自由基生物学。

1 引言

自由基在细胞过程中发挥着至关重要的作用，包括信号传导、代谢调节和免疫防御。同时，过量或失调的自由基产生会导致氧化应激，造成蛋白质、脂质和核酸损伤，并与神经退行性疾病、癌症及衰老相关疾病密切相关。自由基生物学研究的核心挑战在于其固有的短寿命、低稳态浓度和显著的空间异质性，这严重限制了在活细胞中进行直接的、定量的、具有时空分辨率的表征。如表1所示，不同自由基物种在寿命、扩散范围和亚细胞定位上存在显著差异，这些物理化学特性决定了哪些检测策略在生物体系中是可行的。应对这一挑战需要兼具高灵敏度、最小扰动和足够空间分辨率的检测策略，以解析复杂生物环境中的局部自由基动态。传统自由基检测方法，包括发光探针和电子自旋/顺磁共振（ESR/EPR）光谱，虽然极大地推进了对生物氧化还原过程的理解，但仍存在根本性局限。发光探针通常依赖于与活性物种的不可逆化学反应，本质上会扰动局部自由基浓度，并提供间接的时间积分读出。光漂白、细胞毒性和有限的化学特异性进一步限制了其在活体系统中进行长期或定量测量的适用性。相比之下，ESR能直接检测未成对电子自旋，具有高化学特异性和定量准确性，但通常需要进行系综测量、依赖专用仪器，且常需在非生理条件下进行，空间分辨率仅能达到毫米级。因此，现有方法难以在活细胞中同时实现高时间保真度和纳米级空间精度的自由基动态捕捉。金刚石中的氮空位（NV）中心近年来作为一种量子传感平台兴起，能够克服上述诸多限制。NV中心是原子尺度的自旋缺陷，其电子态可在环境条件下进行光学初始化和读出。特别是T₁弛豫测量，通过监测NV中心纵向自旋弛豫时间的变化，能够直接、无标记且无需反应地读出由附近顺磁性物种（包括自由基）产生的局部磁噪声。邻近自由基电子自旋产生的磁噪声会缩短NV^?中心的T₁时间，从而实现空间局域化检测，且不消耗或扰动自由基本身。凭借其卓越的光稳定性、化学惰性和生物相容性，含NV中心的纳米金刚石可被活细胞内化并递送至特定的亚细胞位置，实现单细胞和亚细胞水平的纵向测量。重要的是，T₁弛豫测量对局部顺磁环境敏感，因此可补充基于探针的方法；然而，测得的T₁响应并不能直接识别单个自由基物种，且可能受到局部物理化学环境的影响。本综述将基于纳米金刚石的量子传感置于更广泛的自由基检测技术图景中，首先概述了自由基的生物学作用及其在活体系统中检测的基本挑战，随后简要比较了已建立的自由基检测方法及其内在局限性。接着讨论了基于NV的弛豫测量在生物环境中用于自由基检测的最新进展，重点介绍了当前能力和剩余挑战，包括电荷动力学、纳米金刚石异质性、表面和环境依赖的信号调制以及基于T₁读出的有限化学特异性。最后，探讨了纳米金刚石量子传感在复杂生物模型中的新兴方向和机遇，包括在 multicellular 环境和合成细胞中的零场电子自旋共振（ESR）光谱、T₁弛豫测量，以及反馈控制的驱动和检测系统，将NV赋能的纳米金刚石定位为探测活体系统中自由基生物学的强大功能材料平台。

2 活体系统中的自由基生物学

自由基是指含有一个或多个未成对电子的原子或分子，具有高度反应活性且通常寿命短暂。尽管一个多世纪前由戈姆伯格首次描述，但由于其极端反应性，其与生物学的关联长期存在争议。这一观点在20世纪中叶随着在生物组织中检测到自由基而改变，引发了对自由基在衰老、病理状态和细胞损伤中作用的广泛研究。多年来，自由基主要被视为代谢的有害副产物，超氧化物歧化酶（SOD）作为对抗自由基诱导损伤的专用酶被发现进一步强化了这一认知。随后的发现从根本上修正了这一观点。研究表明，自由基在免疫防御、通过一氧化氮（NO•）产生的血管信号传导以及拉伸生物分子中的机械自由基形成介导的机械敏感信号传导中发挥着不可或缺的作用，包括激素介导的过程。这些发现确立了自由基作为必不可少的信号介质，其生物学功能严格依赖于浓度、定位和时间控制。如今，自由基被广泛认为是具有重要生物学功能的活性中间体，在受控水平下支持生理信号传导，而在失调时则驱动氧化应激和病理过程。在生物系统中，自由基、活性氧（ROS）和活性氮（RNS）这几个术语经常互换使用，尽管存在重要区别。ROS和RNS包含自由基和非自由基物种，而自由基特指含有未成对电子的物质。最主要的生物自由基包括超氧阴离子（O₂•^?）、羟基自由基（•OH）和一氧化氮（NO•），它们主要源于线粒体氧化磷酸化和涉及NADPH氧化酶（NOX）及一氧化氮合酶（NOS）的酶促反应。需氧细胞因此拥有多个细胞内自由基生成位点，超氧化物作为主要ROS前体，可迅速转化为次级活性物种。如表1所示，这些自由基物种在细胞内浓度、寿命和扩散范围上存在显著差异，使得每种物种可获取的生物信息强烈依赖于其生成的位置和方式。线粒体和NOX是大多数细胞类型中超氧化物和过氧化氢的主要内源性来源。

2.1 线粒体来源的自由基

线粒体是公认的细胞内O₂•^?来源之一。分子氧在电子传递链（尤其是复合物I和III）处的部分还原会产生O₂•^?，随后可迅速转化为过氧化氢等次级活性物种。现已确定线粒体自由基形成有助于氧化还原信号传导、代谢调节和应激反应。然而，这些信号在活细胞中的精确量级、时间和线粒体亚定位仍然难以解析，部分原因是许多测量依赖于间接或平均化的读出。目前的工具通常可以检测下游氧化剂、氧化还原反应或累积性损伤，但对活细胞中高度局域化的线粒体自由基通量的直接观察仍然有限。

2.2 NOX来源的自由基

NADPH氧化酶（NOX）的特殊性在于超氧化物产生是其主要的酶促功能。这些酶分布在质膜和内膜系统上，以空间受限的方式产生超氧化物。这一来源在膜附近的信号通路和免疫细胞中尤为重要，其中NOX2驱动的自由基产生支持吞噬体内的呼吸爆发，并在宿主防御期间促进局部抗菌自由基化学。这些过程的存在和功能重要性已得到充分证实，尤其是在宿主防御中。与此同时，吞噬体和膜周微环境中自由基形成的时空组织仍难以在活细胞中直接定义。相比之下，扩散、清除和区室结构如何塑造局部NOX衍生的自由基信号尚不清楚。在许多系统中，现有方法可以确认NOX激活或下游氧化后果，但不能以高空间精度直接揭示局部自由基微环境。

2.3 一氧化氮信号传导及其他局部自由基来源

一氧化氮代表了一种概念上截然不同的自由基，因为它作为一种真正的信号介质发挥作用，而不仅仅是氧化损伤的前体。由NOS产生，NO•调节血管张力、神经传递和免疫反应，其生物学效应强烈依赖于局部浓度和反应伙伴。除了线粒体和NOX酶外，黄嘌呤氧化酶（XO）、环氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450（CYP）酶也会产生额外的局部自由基或ROS生成过程，在特定生理或病理条件下进一步促进局部ROS产生。细胞器如内质网和过氧化物酶体中也会发生区室特异性的ROS生成，进一步增加了细胞内自由基和氧化还原化学的空间复杂性。总之，这些过程在细胞内创造了高度异质和区室化的自由基景观。已确定这些系统有助于区室化的氧化还原化学，但在许多情况下，哪种自由基物种在体内占主导地位，以及观察到的变化反映的是直接自由基产生还是次级下游氧化剂，仍未解决。这种区分在细胞核和DNA损伤背景下尤为重要，因为许多观察到的特征往往是自由基反应的稳定下游终产物，而非对自由基本身的测量。

2.4 疾病相关性

为维持氧化还原稳态，细胞采用严格调控的抗氧化网络，包括SOD、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等酶清除剂，以及谷胱甘肽和维生素C、E等非酶抗氧化剂。虽然该系统在生理条件下能有效限制不受控制的氧化损伤，但即使自由基生成和清除之间的细微失衡也会导致氧化应激，造成大分子损伤并激活氧化还原敏感信号通路。这种失调与多种疾病有关，包括糖尿病、神经退行性疾病、癌症、高血压和炎症性疾病。重要的是，自由基诱导损伤的同一种反应活性也被用于治疗，最显著的是在癌症治疗中，如光动力疗法、声动力疗法、化学动力疗法以及放射治疗。这些方法故意在空间受限区域产生活性细胞毒性自由基物种以诱导受控的细胞死亡（凋亡），强调了精确空间和时间控制自由基产生的重要性。从检测的角度来看，这些生物学特征施加了严格的限制。自由基信号传导和损伤通常是局部的、瞬时的和非化学计量的，发生在远低于非自由基ROS浓度的高度受限的亚细胞微环境中。因此，累积性或间接的读出可能会掩盖起始自由基事件的身份、定位和时机，而基于反应的检测策略则有扰动其旨在测量的天然过程的风险。因此，任何能够在活体系统中解析自由基生物学的方法都应提供高灵敏度、空间精度和最小扰动，这些要求超出了许多现有分析技术的能力范围，并推动了对全新传感策略的开发。

3 细胞中自由基探测的策略

自由基的极端反应性、低稳态浓度和短寿命对其在活体系统中的直接检测构成了重大挑战。在过去的几十年里，人们开发了广泛的策略来探测自由基生物学，包括光学探针、ESR/EPR光谱、氧化损伤标志物、酶活性测定和电化学方法。虽然这些方法提供了宝贵的见解，但它们在灵敏度、特异性、空间分辨率和生物系统扰动方面都面临根本性的权衡。理解这些局限性对于推动开发新的、侵入性更小的检测策略至关重要。如表1所述，自由基检测的可行性在很大程度上取决于目标物种的寿命、扩散范围和定位，这解释了为什么没有一种单一的分析方法能在所有生物相关自由基中表现同样出色。

3.1 基于反应的发光探针

基于反应的发光探针是研究生物系统中自由基相关氧化过程最常用的工具之一，这归功于其实验可及性、表观灵敏度和与标准荧光显微镜平台的兼容性。这些探针能够可视化细胞和组织中的氧化过程，因此被广泛应用于氧化还原生物学、氧化应激研究和药物筛选。它们大致可分为荧光和化学发光系统，两者都依赖于与活性物种的化学反应来产生光学信号。因此，这些探针通常报告化学累积的氧化事件，而不是具有高时空精度的起始自由基物种。荧光探针在与活性氧或氮物种反应后发生转化，形成可通过显微镜或批量荧光测量检测的发色产物。常见的例子包括通用的氧化应激指示剂如2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和二氢罗丹明123，超氧化物响应探针如二氢乙锭（DHE）及其线粒体靶向衍生物MitoSOX，羟基自由基探针如羟苯基荧光素和氨基苯基荧光素，以及基于二氨基荧光素支架的一氧化氮指示剂。尽管被广泛使用，但这些探针并不直接报告自由基本身，而是对下游、次级或探针介导的氧化反应作出反应。例如，DCFH和DHR优先被过氧化氢、过氧化物酶和氧化还原活性金属离子氧化，导致信号放大并丧失化学特异性。此外，荧光产物的光激发会产生促进进一步氧化的活性中间体，导致自催化信号放大和人为读数。因此，这些探针主要报告全局氧化应激，而不是定量的自由基浓度。DHE基探针说明了基于反应的荧光的优势和局限性。超氧化物氧化DHE产生特定产物2-羟基乙锭，而与其他氧化剂的反应则产生乙锭和相关副产物。由于这些物种表现出强烈重叠的荧光光谱，批量荧光测量无法可靠地区分超氧化物衍生的信号与非特异性氧化产物。基于高效液相色谱（HPLC）的氧化产物分离已被引入以提高特异性，但此类方法需要破坏性的样品处理，并且与活体系统中的实时或空间分辨测量不兼容。因此，即使产品分离改善了化学分配，所得分析仍然牺牲了活细胞的连续性和亚细胞空间信息。化学发光探针通过化学反应直接产生光，消除了光学激发的需要，从而减少了背景荧光。经典的例子包括鲁米诺、光泽精和腔肠素，以及最近的酚氧-二氧杂环丁烷体系。这些探针可以实现高灵敏度，并已成功应用于细胞和体内环境。然而，它们在根本上仍是基于反应的，并且经常遭受选择性有限、氧化还原循环、自氧化或受到过氧化物酶和过渡金属离子的干扰。更先进的设计将化学发光或化学荧光反应与半导体聚合物纳米报告基因相结合，实现了增强的亮度和改善的体内性能。虽然这些系统代表了重要的技术进步，但它们的信号仍然来自累积的氧化反应，因此提供的是时间积分的读出，而不是局部自由基生成的即时读数。总体而言，荧光和化学发光探针在应用于自由基生物学时具有内在的局限性。大多数依赖于不可逆的化学反应，会扰动局部氧化还原平衡，对多种活性物种作出反应，并产生时间积分的信号，从而掩盖了起始自由基事件的身份、定位和时机。光漂白、细胞毒性、pH敏感性和酶干扰进一步使定量解释复杂化。当研究活细胞中瞬时、局域化的自由基信号传导时，这些限制变得尤为突出，因为空间限制和时间动态至关重要。因此，迫切需要替代的检测策略，以实现对活体系统中与自由基生物学相关的局部顺磁环境的无反应、最小扰动和空间分辨的测量。

3.2 基于自旋的光谱技术

ESR，也称为EPR，最早由Zavoisky于1944年报道，仍然是检测含有未成对电子物种最直接、化学特异性最高的方法。在ESR中，顺磁性分子在外加磁场中吸收微波辐射，产生反映其电子结构的特征光谱。由于只有顺磁性物种对信号有贡献，ESR对自由基和某些金属离子具有固有的选择性，避免了光学分析中遇到的许多背景效应。

3.3 直接检测

原则上，ESR可以直接检测内源性自由基而无需化学衍生化。然而在实践中，直接检测仅限于相对持久的自由基，这些自由基积累到足够高的稳态浓度，通常是通过电子离域获得更高稳定性的物种，或在特殊条件下连续生成的自由基。内源性自由基通常以非常低的稳态浓度产生，并经历快速的二次反应，通常低于常规ESR在生物样品中的实际直接检测限，因此直接ESR通常仅限于异常稳定的自由基、模型系统中生成的自由基中间体或外源性顺磁性探针。因此，常规ESR提供了优异的化学特异性，但仅限于满足稳定性、丰度和实验可及性等相对严格要求的自由基。报告的实际检测限在生物测量中通常在微摩尔级别，而在活体样品中直接检测内源性自由基往往更具挑战性。

3.4 自旋捕获

为了克服许多自由基的短寿命，ESR最常结合自旋捕获技术。在这种方法中，瞬态自由基与双极性或亚硝基基捕获剂反应，形成寿命更长的顺磁性自旋加合物，可通过ESR检测。重要的是，测得的信号代表的是自旋加合物，而不是原始的自由基本身，因此解释取决于自由基捕获反应和加合物的后续稳定性。因此，通过自旋捕获获得的表观自由基谱不仅反映了潜在的生物学过程，还反映了捕获化学的选择性、动力学和分解途径。目前已开发出多种针对生物相关自由基的自旋捕获剂，包括超氧化物、羟基自由基、一氧化氮、脂质衍生自由基和碳中心物种。其中，5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物（DMPO）仍然是最广泛使用和研究最充分的例子之一，因为其加合物通常显示出特征性的超精细分裂模式，有助于自由基的归属。然而，自旋捕获存在一些众所周知的局限性。捕获效率在不同自由基之间存在显著差异，某些加合物不稳定，竞争性副反应、氧化还原转化或次级自由基的形成会使分析复杂化。在生物系统中，这些问题可能导致对存在的自由基物种的低估、高估甚至错误归属，因此仔细的对照和谨慎的解释至关重要。

3.5 自旋探针

一个相关但在概念上不同的策略是使用自旋探针，特别是环状羟胺。与经典的自旋捕获剂不同，这些化合物不与特定的自由基形成共价加合物。相反，它们被氧化成ESR可检测的氮氧自由基，因此报告的是氧化环境的存在，而不是单一的确定的自由基物种。这一特征通常使自旋探针在细胞系统中更灵敏且在实验上更方便，并且许多探针可以进行化学修饰以改善膜通透性或将特定区室作为靶点，如线粒体。然而，这种实验便利性的提高通常伴随着与结构解析的自旋加合物相比，自由基水平特异性的丧失。同时，所得信号的化学特异性低于结构良好的自旋加合物。羟胺不仅可以被超氧化物衍生的过程氧化，还可以被其他氧化剂、氧化还原活性金属离子和血红素蛋白氧化，因此除非经过正交对照验证，否则该信号最好解释为局部氧化活性的综合指标。适当的对照可能包括SOD、过氧化氢酶、金属螯合剂、选择性酶抑制剂或区室特异性扰动。

3.6 EPR成像（EPRI）

仪器的进步进一步将ESR扩展到通过EPR成像（EPRI）进行空间分辨测量。EPRI能够无创地可视化生物样品中顺磁性探针的分布，并且在绘制组织氧合、探针定位和体内氧化还原相关过程方面特别有用。在大多数生物应用中，EPRI因此可视化的是外源性顺磁性报告基因或探针衍生的对比度，而不是直接的内源性自由基。然而，大多数生物EPRI应用可实现的空间分辨率通常在亚毫米到毫米量级，而不是微米量级，且采集通常需要几分钟而不是几秒钟。因此，EPRI在组织或器官水平上具有信息量，但不适合解析单个细胞或亚细胞区室尺度的自由基梯度。最近的发展，包括紧凑型和移动式EPR成像仪，提高了体内成像的可行性，并实现了活体动物中探针分布和清除的三维绘图，但这些进展并未消除细胞生物学应用的根本空间限制。综上所述，ESR在自由基检测方法中提供了极高的化学特异性，特别是当光谱结构可用于直接识别自由基物种或自旋加合物时。然而，其在活体系统中的应用仍然受到内源性自由基浓度低、需要自旋捕获剂或探针、可能扰动氧化还原稳态、空间分辨率有限以及对动态细胞内测量时间分辨率适中的限制。因此，ESR最好被视为自由基鉴定和机制归属的强大参考方法，当需要最小扰动、亚细胞或纵向测量时，通常由其他技术补充。

3.7 间接损伤和活性读数

由于自由基具有高度反应活性且通常寿命短暂，它们在生物系统中的存在通常间接地从分子损伤产物或参与自由基生成或解毒的酶的活性推断出来。如表1所述，特别是寿命短且空间受限的自由基，如超氧化物和羟基自由基，往往逃避直接观察，这就是为什么下游损伤标志物和酶联测定在氧化还原生物学中被如此广泛地使用。这类方法在氧化应激研究和临床氧化还原生物学中发挥了核心作用，但它们并不检测自由基本身，因此只能间接且通常是时间积分地获取自由基动态。脂质、蛋白质和核酸的氧化修饰是自由基诱导应激最广泛使用的指标之一。多不饱和脂肪酸特别容易发生过氧化，产生丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）等醛类，通常被量化为脂质氧化的标志物。经典测定包括硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS），该方法简单且灵敏，但缺乏化学特异性，因为硫代巴比妥酸会与多种醛类物种反应。荧光脂质探针，如基于BODIPY的报告基因，能够对细胞中的脂质过氧化进行成像，但它们优先与过氧自由基反应，且与内源性抗氧化剂的竞争较差，使定量解释复杂化。蛋白质也是氧化修饰的主要靶标，半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸残基会发生氧化或硝化。核酸的氧化损伤通常通过量化修饰碱基来评估，最突出的是8-氧代-7,8-二氢-2′-脱氧鸟苷（8-oxodG）。重要的是，这些分析物通常是起始自由基事件后积累的稳定的下游终产物，并进一步受到修复、降解和次级反应途径的影响。总体而言，氧化损伤标志物报告的是氧化还原失衡的下游后果，而不是起始自由基事件的身份、定位和时机。另一种间接策略依赖于监测产生、转化或清除自由基的酶，或使用对自由基相关反应性作出反应的酶偶联报告基因检测。一个广泛使用的例子是细胞色素c还原测定法，它利用了铁细胞色素c被超氧化物一电子还原的特性。虽然通常用于量化细胞外超氧化物产生，但该测定缺乏细胞内进入能力，并且容易受到非自由基还原剂的干扰，需要使用SOD进行仔细的对照实验。乌头酸酶失活是另一个常用的超氧化物形成指标，基于其[4Fe-4S]簇的氧化性破坏。乌头酸酶活性的变化可以反映超氧化物水平的变化，但并不具有特异性，因为该酶也会受到一氧化氮和过氧亚硝基的影响。虽然这些方法对于确定自由基产生的潜在来源很有价值，但单独测量酶的丰度或表达并不总是与酶活性或净自由基输出相关，后者取决于亚基组装、辅因子可用性、定位和调节信号。尽管氧化损伤标志物和酶活性测定在确定自由基的生物学相关性方面发挥了重要作用，但它们具有内在的局限性。这些方法是间接的、通常是破坏性的，并且普遍缺乏解析活体系统中局部和瞬时自由基过程所需的空间和时间分辨率。由于许多读数在时间尺度上整合了信号，并受到修复、降解、次级化学