真核生物中DNA聚合酶θ的多样性与进化，以及眼虫类中线粒体定位DNA聚合酶PolIA的起源

《Protist》：Diversity and evolution of DNA polymerase θ in eukaryotes and the origin of mitochondrion-localized DNA polymerase PolIA in euglenozoa

DNA聚合酶θ（Polθ）与PolIA的系统发育关系及起源研究。通过扩大Polθ样本多样性，重建最大似然树发现PolIA嵌套于Polθ中，支持PolIA由Euglenozoa中Polθ基因重复和功能修饰演化而来，并揭示两者垂直遗传的演化轨迹。

　　

井上龙|魏明哲|原田亮|矢崎惠纪|中山隆|瑞安·M.R. 加夫里卢克|稻垣雄二

日本茨城县茨城大学科学技术研究生院

摘要

开创性的系统发育研究表明，两种不同的DNA聚合酶（DNAP）之间存在姐妹关系：一种是存在于细胞核中的Polθ，其分布范围涵盖所有真核生物；另一种是存在于线粒体中的PolIA，仅在线粒体动物（Euglenozoa）中发现。然而，以往的系统发育分析仅使用了有限种类真核生物的Polθ序列，导致PolIA的精确进化轨迹仍不明确。在本研究中，我们利用来自多种真核生物的大量Polθ序列进行了系统发育分析，以更严谨地探讨Polθ与PolIA之间的进化关系。我们得到的最大似然树显示，PolIA分支嵌套在Polθ分支内部。在Polθ序列的演化过程中，PolIA分支专门与在线粒体动物中发现的两种Polθ类型之一发生了分化。这些结果表明，线粒体动物中某种Polθ类型的基因复制产生了该门类特有的PolIA。此外，根据这两种Polθ类型和PolIA的分布情况，我们提出这三种DNAP可能是从祖先线粒体动物垂直遗传给后代的，并在此过程中经历了两次Polθ类型的丢失。

引言

遗传信息从母细胞传递给子细胞，以及从祖先传递给后代，依赖于由复制和修复组成的DNA维护机制。DNA聚合酶（DNAP）以半保留方式复制双链DNA分子，是所有现存生命形式中DNA维护系统的核心。目前已知存在多种具有不同进化起源的DNAP（Filée等人，2002年），但在本研究中，我们重点关注了一种存在于细胞核中的DNAP——Polθ，它与细菌和噬菌体/病毒中的DNA聚合酶I（PolI）在氨基酸序列上具有相似性（属于“A家族”）。

通常，真核细胞包含两个含有基因组的细胞器：细胞核和线粒体，不同的DNAP分别负责维持细胞核和线粒体的基因组。光合真核细胞还拥有自身基因组的质体，需要额外的DNAP来维持质体基因组。迄今为止，所有参与维持线粒体和质体基因组的DNAP都属于“A家族”。最近关于细胞器定位DNAP的进化和多样性的研究表明，这些DNAP在真核生物的进化树上属于不同的分支（原田等人，2024年）。线粒体动物是利用特定于其细胞器的DNAP进行DNA维护的典型例子（Klingbeil等人，2002年；原田等人，2020年；原田和稻垣，2023年）。

线粒体动物门包括三个纲：运动质体纲（Kinetoplastea）、双鞭毛纲（Diplonemea）和眼虫纲（Euglenida），以及一个较小的亚群——共生体目（Symbiontida）（Adl等人，2019年）。除了少数具有质体的眼虫纲成员外，所有亚群均为异养生物。目前已知存在四种细胞器定位的“A家族”DNAP（harA DNAP）：（i）PolIA存在于线粒体中，在线粒体动物中可能普遍存在；（ii）PolIBCD+也存在于线粒体中，但其在不同纲中的分布尚不明确；（iii）眼虫纲成员使用POP（植物和原生生物的细胞器DNA聚合酶）进行线粒体基因组复制；（iv）光合眼虫纲成员使用eugPolA进行质体DNA维护。上述所有细胞器定位的harA DNAP均为线粒体动物所特有，只有POP在线粒体动物以外的多种真核生物中也存在。初步研究已经阐明了三种线粒体动物特异性harA DNAP中的两种（即PolIBCD+和eugPolA）的起源：PolIBCD+可追溯到一种自动图病毒（autographivirus）的PolI，而eugPolA则来源于一种γ-变形菌（Gammaproteobacteria）的PolI（原田和稻垣，2021年；原田等人，2024年）。尽管如此，我们对PolIA的起源仍不如对PolIBCD+或eugPolA的起源那么确定。

先前的系统发育分析多次表明PolIA与Polθ之间存在亲缘关系，后者是一种参与细胞核基因组修复的harA DNAP（Michele等人，2002年）。然而，之前的分析仅使用了少量的Polθ序列。例如，我们曾提出过PolIA与Polθ之间的姐妹关系（原田和稻垣，2023年），但该分析仅使用了人类、拟南芥和紫草虫的Polθ序列，以及一种被认为与Polθ密切相关的H. sapiens Polν序列（如图1A所示）。假设之前分析中发现的PolIA与Polθ之间的亲缘关系成立，我们基于从更多种真核生物中获取的Polθ序列提出了两种可能的PolIA起源情景（图1B和C）。在第一种情景中，即使增加了Polθ样本的多样性，PolIA与Polθ之间的姐妹关系仍然成立（图1B）。这种树形结构表明PolIA是与Polθ亲缘关系最近的DNAP；但从严格意义上讲，这并不符合PolIA从Polθ进化而来的预期。第二种情景中，PolIA可能在线粒体动物中从Polθ的分支中独立演化出来（图1C）。在这种情景下，我们可以将PolIA出现的真核生物群体视为Polθ通过复制并发生功能修饰后直接分化出PolIA的群体。为了探究PolIA的起源，我们首先通过调查广泛真核生物中的这种harA DNAP的多样性来提高样本覆盖率，然后对包含Polθ和PolIA序列的新比对进行了系统发育分析。

Polθ的多样性

在图2中，我们展示了基于“Polθ+IA比对”推断出的最大似然（ML）树，该比对包含了202个Polθ序列、42个PolIA序列、4个acPolA序列和12个细菌PolI序列。虽然图中未显示，但我们实际上是以acPolA和细菌PolI序列作为根节点构建的。完整的ML树（包含统计支持信息）以Newick格式的树文件提供，可通过系统发育树可视化工具进行查看。图中Polθ和PolIA分支的颜色编码见图2插图。

讨论

本研究通过调查不同真核生物中的Polθ多样性，阐明了线粒体动物特有的PolIA（一种线粒体定位DNAP）的起源。我们的研究发现，Polθ具有普遍的真核生物分布，并且多个亲缘关系不密切的真核生物亚群中都存在多种不同的Polθ类型。线粒体动物似乎是拥有多种Polθ类型的真核生物分支之一。

Procryptobia sorokini的RNA-seq分析

Procryptobia sorokini B-69菌株在混合细菌群体中进行了克隆培养。细胞在室温下以2000 x g的离心力被浓缩到0.8 μm的Vivaclear Mini柱膜上（Sartious公司）。总RNA使用RNAqueous-Micro Kit（Invitrogen公司）提取，cDNA使用SMARTer Pico PCR cDNA合成Kit（Clontech公司）生成。使用NexteraXT协议（Illumina公司）制备了双端文库，并在Illumina平台上对2×301 bp的读段进行了测序。

CRediT作者贡献声明

井上龙：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验研究、数据分析。魏明哲：撰写初稿、数据可视化、实验研究、数据分析。原田亮：方法设计、实验研究、概念构建。矢崎惠纪：撰写初稿、方法设计、实验研究、数据分析。中山隆：方法设计、实验研究、资金筹集。瑞安·M.R. 加夫里卢克：撰写初稿、资金筹集、数据分析。稻垣雄二：撰写

资助

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的资助（项目编号23K27226和BPI06050，资助对象为稻垣雄二；项目编号24K09587，资助对象为田中隆）。RMRG获得了加拿大自然科学与工程研究委员会（NRC）的资助（项目编号RGPIN-2019-04336）。RH获得了JSPS海外研究奖学金的资助。RI获得了JST SPRING的资助（项目编号JPMJSP2124）。

未引用的参考文献

Wood和Doublié，2016

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。