《Magnetic Resonance in Chemistry》：Integrated Reaction Monitoring and In Situ Structural Elucidation of Reactive Intermediates With Time-Resolved NOAH NMR Supersequences
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反应中间体和副产物的结构解析对于机制理解通常至关重要。然而，这些物种的单独分离往往耗时、劳动密集且在技术上极具挑战，甚至不可能实现。本研究提出了一种核磁共振（NMR）实验工作流程，涉及在活性反应过程中使用NOAH（通过${^1}$H检测进行有序采集的NMR）超
反应中间体和副产物的结构解析对于机制理解通常至关重要。然而，这些物种的单独分离往往耗时、劳动密集且在技术上极具挑战，甚至不可能实现。本研究提出了一种核磁共振（NMR）实验工作流程，涉及在活性反应过程中使用NOAH（通过${^1}$H检测进行有序采集的NMR）超序列串联采集多种二维（2D）NMR谱的时间分辨获取和处理。这种时间分辨NOAH非均匀采样（TR-NOAH-NUS）方法使得在平行进行反应组分结构表征的同时，能够生成用于动力学分析的稳健的浓度-时间曲线。本研究展示了TR-NOAH-NUS在有机催化醇酰基化反应中的应用。尽管反应时间跨度较短（30分钟），研究人员仍能以优异的时间分辨率（小于15秒）获得高质量的异核单量子相干（HSQC）、异核多键相关（HMBC）和相关光谱（COSY）谱图。从这些数据中，研究人员能够观察到循环内催化中间体和循环外催化剂降解产物，并直接指认两者的结构，无需进一步分离。
反应中间体及副产物的结构表征对于全面理解反应机制及区分不同潜在反应路径至关重要。核磁共振（NMR）作为一种强大的反应监测技术，能够提供具有良好时间分辨率的定量动力学信息以及细微的结构信息[1, 2]。尽管大多数NMR反应监测主要利用一维（1D）技术，如${^1}$H和${^{19}}$F监测，但这些方法常因谱图重叠或核素数量限制而提供不足的结构细节。虽然部分副产物可单独分离表征，但这一过程耗时且对于反应中间体而言往往不可行[1]。二维（2D）NMR虽是结构表征的金标准[3]，但其实验时间显著长于1D NMR。尽管非均匀采样（NUS）[4-6]及超快2D技术[7-9]等创新缩短了实验时间，且NOAH（通过${^1}$H检测进行有序采集的NMR）超序列通过磁化共享大幅减少了全表征套件的时间[10-12]，但由于2D技术较长的采集时间及灵敏度挑战，其在原位反应监测中的应用仍不常见[13-15]。早期的时间分辨2D NMR研究主要依赖单一的2D技术[23]，然而完整的结构解析通常需要结合多种2D实验的信息。鉴于存在与NUS兼容的NOAH超序列变体[24]，本研究旨在探索将时间分辨NUS（TR-NUS）处理技术应用于NOAH-NUS采集数据，以获取随反应进展而时间分辨的多种2D谱图系列，并验证其在有机催化酰基化反应中间体结构解析中的应用价值。
研究人员开展了基于时间分辨NOAH非均匀采样（TR-NOAH-NUS）的实验研究，以监测由(-)-苯四咪唑（BTM）催化的手性醇酰基化反应。研究采用了包含异核单量子相干（HSQC）、异核多键相关（HMBC）和相关光谱（COSY）模块的NOAH超序列，并结合非均匀采样（NUS）及多维分解（mdd）后处理方法。样本队列来源于实验室内部进行的有机催化反应体系，具体为(S)-1-苯基乙醇与丙酸酐在BTM催化下的反应，使用CDCl$_3$作为溶剂。研究通过优化NUS采样计划及数据处理窗口，旨在最小化反应监测的“死时间”并提高信噪比（SNR）及时间分辨率，从而实现对反应过程中瞬态中间体和副产物的原位结构指认。
研究结果如下：
2.1 对映选择性酰基化—中间体和循环外物种的鉴定
通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）在线动力学监测发现多种催化活性（5）和抑制性（6）物种，但仅凭质谱缺乏详细结构信息。一维NMR谱图提供的结构信息也不充分且模糊，因此研究人员利用时间分辨二维数据来识别这些物种。
2.2 NOAH在反应监测中应用的考量
NOAH通过共享恢复延迟（D1）并谨慎保留磁化强度和未使用的相干性，实现了多个${^1}$H检测2D NMR实验的同时采集。为确保半定量HSQC数据的准确性，研究人员将HSQC设置为NOAH序列的第一个模块，并仔细选择${^1}J_{HC}$值（145 Hz）。
2.3 时间分辨NUS在反应监测中应用的考量
传统的2D NMR采集均匀数组数据点，而NUS通过采集稀疏随机子集并重构全谱来缩短时间。在TR-NUS中，通过限制间接维度采样点上限（t1$_{max}$）并选择适当的处理窗口大小，以平衡信噪比（SNR）和时间分辨率，避免对动力学曲线的过度平均。
2.4 通过TR-NOAH-NUS进行动力学监测及消除反应监测“死时间”
研究人员收集了一系列771个HSQC谱图，其积分得到的浓度-时间曲线与传统1D动力学监测结果高度一致。为解决初始时刻的反应“死时间”（约5分钟），研究人员提出将反应启动前的NUS谱图数据与启动后的数据合并重构。这一新颖的重构过程显著降低了监测死时间，提高了瞬态催化物种动力学趋势的质量，并证实了即使对于快速反应（40分钟内完成），该方法也能有效捕捉早期反应数据，但需注意其对极快过程（如在第一点数据采集前完成的活化过程）的局限性。
2.5 催化剂相关物种的结构解析
通过时间分辨HMBC谱图分析，研究人员确定了物种5为BTM催化剂（4）的酰基化形式，即循环内中间体。物种6被鉴定为含三个羰基的副产物，其中201 ppm处的信号指示其为硫酯结构，这是一种循环外的催化剂降解产物。通过结合HSQC、HMBC和COSY数据，研究人员在不分离的情况下直接指认了这两种物种的结构。
在讨论部分，研究人员指出TR-NOAH-NUS技术首次实现了HSQC、HMBC和COSY谱图的串联采集，并在活体反应过程中保持良好的时间分辨率。该分析不仅识别了真正的酰基化中间体物种，还完成了催化剂分解物种的全结构解析，无需进一步分离或额外实验。特别是后者，需要结合该方法获得的不同2D实验信息。在本案例研究中，精心选择${^1}J_{CH}$值使得NOAH-HSQC谱图能够以半定量方式采集，生成的时间课程数据与使用传统1D测量获得的动力学数据显示出极好的一致性。研究人员还提到，近期工作已开发出完全定量的HSQC谱图[36]，目前研究组正致力于将定量HSQC（qHSQC）技术整合到TR-NOAH-NUS工作流程中。
该研究得出结论，TR-NOAH-NUS技术是一种有效的工具，能够实现多种2D NMR谱图的时间分辨串联采集，从而在无需分离的情况下对反应中间体和副产物进行原位结构解析。这种方法在提供精确动力学数据的同时，解决了传统NMR监测在结构表征上的不足，特别是在处理快速反应和瞬态物种方面展现了显著优势。论文发表于《Magnetic Resonance in Chemistry》。
论文作者：S.M.G., J.Z., Y.B.T., M.D., J.E.H.
