《Veterinary Microbiology》：Genetic and Biological Characterization of a Duck-Origin Clade 2.3.4.4b H5N6 Avian Influenza Virus Reveals Partial Mammalian Adaptation
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本研究鉴定并分析了一株2022年从中国东部活禽市场分离的鸭源H5N6高致病性禽流感病毒（A/Duck/Jiangsu/628/2022），发现其HA基因与同期人间H5N6毒株（A/Yangzhou/125/2022）核苷酸一致性达98%以上，携带增强人类受体结合（S137A, T160A, T192I）、神经氨酸酶抑制剂耐药突变（I117T, D198N）及哺乳动物细胞复制促进突变（PB1-D622G, PA-K142Q）。体外实验显示其在哺乳动物细胞中复制效率更高，具有禽-人双重受体结合特性；动物实验证实其具有中度小鼠致病性及气溶胶/直接接触传播能力，提示该毒株可能提升人间大流行风险，需加强候鸟种群、活禽市场和禽类疫苗接种监测。
张新兰|陈静|葛志创|卢小龙|陈宇|胡娇|刘晓文|胡顺林|刘开拓|王晓全|张平湖|顾敏|高瑞仪|刘秀凡
中国农业与农村事务部禽类生物制品开发重点实验室，扬州大学兽医学院，中国扬州225009
摘要
2.3.4.4b支系的H5Nx高致病性禽流感病毒（HPAIVs）在全球范围内引发了广泛的家禽疫情。H5 HPAIVs在中国也导致了零星但严重的人类感染，构成了持续的人畜共患病威胁。本研究通过常规监测发现了一种源自鸭子的H5N6 HPAIV（A/Duck/Jiangsu/628/2022），并评估了其生物学特性和在哺乳动物中的致病性。系统发育分析显示，628株与同期的人类H5N6株A/Yangzhou/125/2022之间的核苷酸同源性超过98%。分子特征分析发现了多个与哺乳动物适应性相关的标志：血凝素突变（S137A、T160A、T192I）增强了与人类受体的结合能力；神经氨酸酶突变（I117T、D198N）降低了神经氨酸酶抑制剂的敏感性；聚合酶复合体变化（PB1-D622G、PA-K142Q）促进了在哺乳动物细胞中的复制。体外研究表明，628病毒在哺乳动物细胞中的复制效率高于在鸟类细胞中，并且具有双重受体结合特性。小鼠致病性实验显示该病毒具有中等毒力并伴有进行性肺病理变化。关键的是，传播实验证实628病毒既可以通过直接接触也可以通过空气在豚鼠之间传播。这些发现表明，循环中的H5N6病毒已经获得了部分哺乳动物适应性，同时保持了其在鸟类中的适应性，显著增加了大流行的潜力。因此，迫切需要加强对野生鸟类种群、家禽养殖场和活禽市场的监测，以制定有效的预防和控制策略。
引言
禽流感病毒（AIVs）属于正粘病毒科，具有单链负义分段RNA基因组，包含八个基因片段。这些片段编码至少十种主要蛋白质，包括三个聚合酶亚基（PB2、PB1和PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2/NEP）（Taubenberger和Kash，2010）。根据两种表面糖蛋白HA和NA的抗原特性，AIVs被分为16个HA亚型（H1–H16）和9个NA亚型（N1–N9）。野生水禽几乎是所有已知亚型的自然宿主（Liu等人，2022）。根据它们在家禽中的毒力和HA切割位点的氨基酸序列，AIVs可以进一步分为高致病性禽流感病毒（HPAIVs）和低致病性禽流感病毒（LPAIVs）。
自1996年Gs/GD谱系H5N1 HPAIV出现以来，H5亚型HPAIVs一直持续引发疫情，对动物和公共卫生构成持续威胁（Xu等人，1999）。在过去几十年中，Gs/GD谱系的HA基因分化为多个支系和亚支系，与各种NA基因的频繁重组产生了多种H5Nx亚型，包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5和H5N6（Xiong等人，2025）。特别是，2.3.4.4b支系的病毒近年来在全球范围内在鸟类和哺乳动物中引发了持续性的疫情，并有零星的人类感染和死亡病例报告（Qu等人，2024）。自2021年以来，2.3.4.4b支系中出现的新H5N1和H5N6 HPAIVs从先前占主导地位的H5N8病毒中获得了HA基因，成为中国的主要流行亚型（Kandeil等人，2023；Lin等人，2024；Zeng等人，2024）。值得注意的是，这两种亚型的共存促进了进一步的重组，产生了携带来自H5N1病毒的HA和内部基因的新H5N6病毒，这些病毒在家禽和小鼠中表现出增强的毒力（Zhang等人，2025）。尽管中国实施了强制疫苗接种计划，但在水禽中实现足够的抗体保护覆盖率仍然具有挑战性（Sun等人，2022）。最近的监测数据显示，H5N6是鸭子中第三大常见检测到的亚型，仅次于LPAI H9N2和H6N6病毒，这种在水禽中的广泛共存为进一步的重组和进化提供了机会（Yang等人，2025）。近年来，在水禽和野生鸟类中不断检测到新的重组H5N6病毒，其中一些携带可能引发大流行的哺乳动物适应性突变（Ke等人，2024；Zhang等人，2022）。因此，加强对这些鸟类群体中H5N6病毒的监测至关重要。
H5N6亚型HPAIV也显示出在中国多个省份感染人类的能力，包括江苏、浙江、上海、福建和四川（Zhu等人，2022）。截至2025年8月，中国共报告了92例实验室确认的H5N6 AIV感染病例，2021-2022年间病例数显著增加（WHO 2025）。特别值得注意的是，2022年在江苏省报告的一例病例涉及一种新的重组H5N6病毒，命名为A/Yangzhou/125/2022，该病毒是从患者的脑脊液样本中分离出来的。与大多数主要表现为严重呼吸道疾病的HPAIV感染者不同，这名患者出现了急性脑炎（Zhang等人，2022）。虽然人类感染H5亚型AIVs通常与直接接触家禽有关（Dinh等人，2006），但该病例中没有记录到这种接触；相反，患者的居住环境涉及与野生水禽的接触。这一观察结果提示某些新的重组H5N6病毒可能无需在中间宿主体内适应即可直接感染人类，进一步强调了持续监测水禽的公共卫生重要性。
2022年6月，我们在中国东部活禽市场的常规禽流感监测中分离出一种源自鸭子的H5N6 HPAIV株。全基因组测序显示，该分离株与人类H5N6株A/Yangzhou/125/2022具有高度的核苷酸序列同源性。为了进一步研究该病毒的生物学特性并评估其在哺乳动物中的感染潜力，我们进行了一系列体外和体内实验。我们的发现为风险评估以及2.3.4.4b支系H5亚型HPAIV的预防和控制提供了科学依据。
实验部分
病毒和细胞
A/Duck/Jiangsu/628/2022（H5N6）（简称628）是由我们的实验室在2022年从中国东部活禽市场的咽拭子和泄殖腔拭子样本中分离出的H5N6亚型HPAIV。过滤后，将拭子样本接种到10天大的无特定病原体（SPF）胚胎鸡胚中（浙江丽华农业科技有限公司），然后在37°C下孵育。所有含有血凝活性的尿囊液
系统发育分析
为了探索628病毒的遗传关系，我们使用IQ-TREE软件根据GISAID数据库中的可用基因片段构建了628病毒的系统发育树。系统发育分析表明，628病毒的HA基因属于2.3.4.4b支系，该支系目前与全球范围内的疫情相关。此外，628病毒与2021-2022年间分离出的多种人类H5N6株聚类在一起（图1）。628的基因分析显示
讨论
近年来，在能够跨物种传播的多种AIV亚型中，H5N6病毒在中国引发了零星的人类感染（Tran等人，2024）。值得注意的是，2024年报告了三例由H5N6病毒引起的致命人类病例，这些病毒的遗传特性与源自鸭子的H5N6株密切相关（Wang等人，2025）。作为多种AIV亚型的自然宿主，水禽和野生鸟类在这些病毒的地理传播中起着关键作用
结论
628株的分离和特征描述是中国监测2.3.4.4b支系H5N6病毒的重要发现。这种源自鸭子的628株与人类H5N6分离株具有密切的遗传关系，携带多个与哺乳动物适应性相关的标志，并在哺乳动物细胞中表现出增强的复制能力、在中等毒力以及有限的动物间传播能力。这些发现突显了这些病毒对公共卫生的潜在影响
伦理批准
本研究严格遵循了中华人民共和国科学技术部《实验动物护理和使用指南》中的规定。所有涉及活毒H5N6病毒和动物的实验均在扬州大学的动物生物安全3级（ABSL-3）设施中进行，符合机构生物安全手册中的建议。
CRediT作者贡献声明
刘晓文：资金获取。王晓全：资源提供。刘秀凡：项目管理。陈静：研究调查。葛志创：验证。胡顺林：资金获取。刘开拓：资源提供。胡娇：监督。顾敏：资源提供、资金获取。高瑞仪：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。张新兰：撰写 – 初稿。张平湖：资源提供。陈翔：资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1800601, 2022YFC2604201）、国家自然科学基金（32402876）、江苏省自然科学基金青年项目（BK20220580）、江苏省人畜共患病重点实验室开放项目（编号R2301）以及中国农业研究系统专项基金（CARS-40）的支持。
