鉴定能够过量产生OMVs（细菌外膜囊泡）的沙门氏菌肠炎血清型Enteritidis突变体作为疫苗候选株

《Veterinary Microbiology》：Identification of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants overproducing OMVs as vaccine candidates

沙门氏菌外膜囊泡疫苗开发：基于FM1-43荧光筛选鉴定Tol-Pal系统及膜相关基因缺失株，发现ΔtolQ/ΔtolR/ΔtolA显著提高OMV蛋白含量，ΔoxyR丧失运动性，ΔdegS OMV脂质含量最高，为禽类沙门氏菌亚单位疫苗提供新候选株。

　　

何恒旭|姜曦|罗志江|王丽红|宋新毅|王振宇|焦欣楠|李秋春

中国农业部农业食品安全与质量生物危害因子（动物源）防控重点实验室，扬州大学

摘要

肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis）血清型仍然是导致人类和动物感染的主要血清型之一。在养禽场中，它经常被报道为感染的主要原因。因此，开发针对S. Enteritidis的疫苗被认为是控制禽类细菌感染的关键策略。外膜囊泡（OMVs）已成为预防动物和人类细菌感染的有前景的疫苗候选物。然而，从野生型Salmonella中自然产生的OMVs产量较低，限制了其大规模应用。FM1-43是一种亲脂性荧光染料，在与细胞膜特异性结合时会发出荧光。在这项研究中，我们建立了一种基于FM1-43的筛选方法，从构建的S. Enteritidis Tn5转座子突变体库中鉴定出高产OMVs的突变体。利用这种方法，我们成功恢复了之前报道的Tol-Pal系统突变体（ΔtolQ、ΔtolR和ΔtolA），从而验证了该方法的实用性。此外，我们还鉴定了五种新的高产OMVs突变体：ΔftsK、ΔxerD、ΔoxyR、ΔdegS和ΔwzxE。在鉴定的28个突变体中，ΔtolQ、ΔtolR、ΔtolA和ΔftsK的OMVs蛋白水平显著高于野生型，而ΔdegS突变体积累了最高的脂质水平。表型分析显示，七个突变体的运动能力降低，其中ΔoxyR完全丧失了运动能力，而ΔtolQ和ΔxerD则表现出增强的生物膜形成能力。抗菌敏感性测试进一步表明，ΔtolQ、ΔtolR和ΔtolA对环丙沙星和多粘菌素更敏感。这些发现表明，参与细菌膜完整性的基因在OMVs的产生中起着关键作用。这里鉴定出的高产OMVs突变体为开发针对S. Enteritidis感染的亚单位疫苗提供了有希望的候选物。

引言

沙门氏菌是一种主要的食源性病原体，在全球范围内导致人类和动物感染。它包含超过2,600种血清型，目前被分为两个物种：肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）和Bongori沙门氏菌（Fierer, 2022; Lamichhane et al., 2024）。人类感染主要是由于摄入被沙门氏菌污染的食物或水引起的，导致诸如胃肠炎等疾病（Helmy et al., 2017, Wiedemann et al., 2014, GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators, 2019）。侵袭性非伤寒沙门氏菌（iNTS）疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一（GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators, 2019）。典型症状包括腹泻和发热，而严重病例可能发展为威胁生命的状况，如脑膜炎、菌血症和骨髓炎（Bula-Rudas et al., 2015）。全球沙门氏菌病的平均病死率约为15%，每年有超过530,000例病例，其中包括约77,500例由iNTS引起的死亡（Li et al., 2022, Marchello et al., 2022）。肠炎沙门氏菌血清型Enteritidis（S. Enteritidis）是最常见的iNTS临床血清型之一，通常与受污染的禽类产品相关（Zheng et al., 2025）。在中国，它仍然是从腹泻患者中分离出的主要血清型（Wang et al., 2023a）。S. Enteritidis仍然是禽业中最常见的血清型（Uribe-Diaz et al., 2025）。S. Enteritidis在成年鸟类中的感染通常是无症状的；然而，受感染的成年鸟类可能成为持续携带者。相比之下，幼鸟通过水平和垂直传播容易患上严重的系统性疾病（Shaji et al., 2023）。新孵化的肉鸡感染S. Enteritidis噬菌体类型4的死亡率可高达96%（Barrow, 1991）。此外，携带S. Enteritidis的禽类可以污染肉类和蛋类产品，通过食物链传播给人类，导致食源性疾病爆发（Zhang et al., 2025）。鉴于S. Enteritidis对全球公共卫生的重大威胁，迫切需要开发针对这种病原体的有效疫苗。

外膜囊泡（OMVs）是球形双层纳米结构，直径通常在20到200纳米之间，由革兰氏阴性细菌持续分泌（Liang et al., 2022, Micoli and Maclennan, 2020, Sartorio et al., 2021）。OMVs由脂质、脂多糖（LPS）、周质蛋白、外膜蛋白和核酸组成（Blenkiron et al., 2016, Tang et al., 2024）。OMVs来源于细菌的外膜。它们自然展示多种表面抗原（例如LPS和外膜蛋白），能够诱导免疫反应（Mancini et al., 2020）。此外，它们的纳米级大小有助于免疫细胞的摄取，促进高效的抗原处理和呈递。OMVs已被证明可以通过几种机制激活先天性和适应性免疫反应：（i）通过Toll样受体（TLRs）和NOD样受体（NLRs）刺激树突状细胞和巨噬细胞（Bierwagen et al., 2023, Kaparakis-Liaskos and Ferrero, 2015）；（ii）通过MHC II类分子增强抗原呈递并诱导CD4⁺ T细胞反应（Lim et al., 2022）；（iii）由于其表面暴露的高度保守的病原体相关分子模式（PAMPs）引发强烈的先天免疫（Lim et al., 2022, Zariri et al., 2016）；以及（iv）通过腔内封装的抗原触发特定的适应性免疫反应。总体而言，这些协同特性使OMVs成为一种非常有前景的疫苗候选物，能够提供保护性免疫。

通过超离心从细菌培养上清液中提取的外膜囊泡（OMVs）保留了完整的膜结构和天然成分。然而，野生型（WT）菌株产生的OMVs产量通常较低，并可能被毒力因子污染（Micoli and Maclennan, 2020, Ferrari et al., 2006, Nevermann et al., 2019, Tian et al., 2024）。另一方面，使用脱氧胆酸钠提取的OMVs具有较低的内毒素活性，并已成功纳入许可疫苗中（例如脑膜炎球菌OMV疫苗）。然而，洗涤剂处理可能会破坏膜完整性并导致保护性抗原的丢失，从而降低免疫原性（Mancini et al., 2020, Skidmore et al., 2023）。另一个主要限制是在标准培养条件下OMVs的产量本身就较低（Balhuizen et al., 2021）。为了克服这些挑战，已经应用基因工程来提高OMV产量，同时降低LPS的毒性，生成了称为通用膜抗原模块（GMMAs）的囊泡（Mancini et al., 2021, Rossi et al., 2014）。值得注意的是，删除Tol-Pal系统中的基因——这是决定外膜完整性的关键因素——已被证明可以显著增加OMV的释放（Nevermann et al., 2019, Bernadac et al., 1998, Reimer et al., 2021）。尽管在沙门氏菌中已经报道了Tol-Pal系统的缺失以促进OMV分泌，但仍然缺乏全面系统的调查来识别其他与OMV生物发生相关的基因。在这项研究中，我们建立了一种基于荧光的定量测定方法，用于筛选S. Enteritidis的转座子突变体库，并鉴定出高产OMVs的突变体。在基因鉴定后，构建了靶向缺失，并量化了所得OMVs的脂质和蛋白质含量，以评估生产水平。这些突变体代表了开发优化高产OMVs菌株的有希望的候选物。

部分片段

细菌菌株

S. Enteritidis CMCC 50041（C50041）菌株来自中国兽药控制研究所。该菌株及其衍生的突变体在37°C的 aerobic 条件下于Luria-Bertani（LB）培养基中培养。需要时，按以下浓度添加以下抗菌剂：羧苄青霉素（Carb, 100 μg/mL）、氯霉素（Cm, 25 μg/mL）和卡那霉素（Km, 50 μg/mL）。

S. Enteritidis的Tn5转座子突变体库

使用携带Tn5转座子的pSC189质粒构建插入突变体

基于FM1-43的筛选方法的评估

为了验证建立的筛选方法（图1A），我们使用了之前构建的S. Enteritidis C50041 ΔtolR突变体（Jiang et al., 2022a），该突变体以高产OMVs而闻名。结果显示，ΔtolR突变体的上清液荧光强度明显高于野生型菌株（图1B）。从两种菌株中提取的OMVs用作对照，进一步证实了ΔtolR突变体产生的OMVs比野生型菌株更多

讨论

本研究建立了一种筛选方法，用于鉴定OMV产量增加的沙门氏菌突变体。先前已知的属于Tol-Pal系统的基因的恢复进一步验证了这种方法的有效性（Kowata et al., 2016, Lazzaroni et al., 1999）。该系统利用质子动力穿过内膜到达肽聚糖层，从而保持外膜的稳定性（Baccelli et al., 2022, Szczepaniak et al., 2020）。删除tolQ、tolA或tolR

结论

总之，我们建立了一种基于FM1-43的筛选方法，并从构建的S. Enteritidis Tn5转座子突变体库中鉴定出八种OMV产量增加的S. Enteritidis突变体。从Tol-Pal系统中恢复tolR、tolA和tolQ突变体验证了这种方法的可靠性。此外，携带与膜成分和应激反应相关基因的五个突变体突显了膜完整性与OMVs生物发生之间的密切联系。

CRediT作者贡献声明

罗志江：撰写——原始草稿、方法学、调查、数据管理。王丽红：调查、形式分析、数据管理。何恒旭：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查、形式分析。姜曦：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查。焦欣楠：方法学、形式分析、概念化。李秋春：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、监督、项目管理、方法学

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（32503140）、中国国家重点研发计划（2024YFE0198800; 2023YFD1800503）、江苏省高等教育机构自然科学基金（25KJB230005）、江苏省人畜共患病重点实验室重大独立研究项目（RZZ202302）、江苏省研究生研究与实践创新计划（SJCX23_2007）以及江苏省优先学术计划发展的支持