藻酸盐/层状双氢氧化物复合气凝胶，用于3D培养和支架构建

《Biomaterials Advances》：Alginate/layered double hydroxide composite aerogels for 3D culture and scaffolding

Alginate/LDH复合气凝胶促进骨再生研究显示，LDH负载骨诱导小分子（如甘油磷酸、抗坏血酸）可改善材料机械性能和生物活性。气凝胶快速水合后实现均匀细胞分布，支持3D骨前体细胞增殖分化，并促进羟基磷灰石沉积。结构稳定性受LDH阴离子种类影响，甘油磷酸负载组长期稳定性下降。研究为骨组织工程提供了新型生物活性水凝胶载体。

　　

Juan P. Zanín|German Gil|Ricardo Rojas

科尔多瓦物理化学研究所（INFIQC），CONICET。物理化学系，科尔多瓦国立大学化学科学学院。科尔多瓦大学城，5000，阿根廷

摘要

尽管海藻酸盐（Alg）水凝胶在支持细胞粘附、增殖和分化方面存在固有的局限性，但它们仍被广泛研究作为3D细胞培养的支架。引入无机填料（如层状双氢氧化物（LDH）有望提高这些材料的机械和生物性能。在本研究中，合成了与骨诱导小分子（OSM）插层的LDH，并将其掺入高孔隙率的海藻酸盐气凝胶中。这些气凝胶在保持整体形状和尺寸的同时表现出快速的水合特性，仅在5-10周后出现显著形态变化。这种快速再水合促进了MC3T3-E1小鼠前成骨细胞在整个支架体积内的即时均匀接种。所得到的支架在五周以上时间内保持了结构完整性——这一效果还得到了LDH颗粒的进一步增强。然而，插层阴离子也是一个决定性因素，其中负载甘油磷酸盐的LDH导致长期结构完整性的下降。此外，这些支架还作为在模拟体液介质中沉积类磷灰石材料的模板。虽然所有海藻酸盐支架都支持细胞生长，但含有LDH的复合材料显示出更好的增殖和分化能力，这些能力受到特定插层阴离子的调节。尽管细胞增殖主要集中在与培养基接触的支架表面附近，但结构稳定性和初始细胞分布表明，这些气凝胶是3D细胞培养和骨组织工程应用的有希望的前体。

引言

骨组织在受伤后可以再生，但大的缺陷或同时存在的条件（如年龄）可能会阻碍这一过程。在这种情况下，需要具有最佳骨传导性和骨诱导性的骨移植材料。自体骨移植是治疗骨缺陷的金标准，但提取部位的发病率和感染是固有的风险。因此，开发具有类似或更好功能的合成骨移植材料对于有效的骨再生至关重要[1]。

这一追求推动了材料科学和生物医学工程的显著进步。骨组织工程的最新进展强调了多组分支架的开发，其中支架的架构和生物活性信号的可控释放被精心设计以促进骨形成[2]。在探索的各种方法中，水凝胶因其能够在不溶解的情况下容纳大量水分而受到广泛研究，从而允许氧气和营养物质的运输，类似于细胞外基质[3]。通过负载药物、无机颗粒、干细胞、生长因子或自体物质（如富含血小板的血浆或骨髓抽吸物）[4]、[5]，水凝胶可以放大和优化其功能。水凝胶基质已通过多种方法制备成薄膜、珠子甚至3D结构。冷冻干燥方法可以生产出具有互连多孔结构和高水合率的气凝胶[6]、[7]。这些多孔结构有利于3D细胞培养，因为细胞可以通过简单接触细胞分散液轻松扩散到水合支架的内部。

海藻酸盐（Alg）是一种天然衍生的多糖，由于其优异的生物相容性、凝胶化特性和易于改性而成为一种有前景的水凝胶材料[8]。然而，其使用受到较差的机械性能以及较低的细胞粘附和增殖能力的限制[9]、[10]。药物与Alg结构的结合力较弱，在交联过程中或生物条件下会迅速丢失。为了改善Alg的机械性能、生物活性和药物释放特性，使用了羟基磷灰石、石墨烯、粘土和层状双氢氧化物（LDH）等无机颗粒[11]。

LDH是一种具有类似滑石层的带正电荷的固体，这些层可以插入各种阴离子（包括药物和生物活性分子）之间。这些阴离子在生物条件下通过阴离子交换和风化反应释放出来。LDH有利于各种类型细胞的粘附和增殖[12]。此外，它们还可以上调与骨形成相关的基因，并促进成骨细胞系中的矿化和细胞外基质（ECM）的产生[13]、[14]。因此，LDH已被用于提高壳聚糖、明胶或纤维蛋白等水凝胶的骨整合能力并调节其机械性能[15]、[16]。LDH颗粒通过静电相互作用与带负电荷的聚合物（如海藻酸盐）结合[17]。Alg/LDH系统能够实现持续的药物释放[18]、[19]，并减少萘普生等药物的细胞毒性[20]。

海藻酸盐/LDH复合水凝胶为骨再生应用中的细胞接种和药物输送提供了一个多功能平台。这些水凝胶可以定制以创造一个最佳的微环境，为封装的细胞提供机械支持和促进细胞存活、增殖和分化的生物活性信号。通过控制释放骨诱导小分子（OSM），可以进一步改善Alg/LDH支架的骨诱导能力。这些低分子量有机化合物（小于1000 Da）激活促进干细胞分化为骨形成谱系的细胞内信号通路[21]、[22]。因此，β-甘油磷酸盐（Gly）和抗坏血酸（Asc）是骨形成分化的培养基中的常见成分[23]、[24]。另一方面，雷索德隆（Ris）是一种抑制骨吸收的物质，可以防止与骨质疏松症相关的骨密度损失[25]。

在这项工作中，探索了含有OSM的复合Alg/LDH水凝胶作为促进骨再生的生物活性支架。合成了与三种OSM（Gly、Asc和Ris）以及两种无机阴离子（Cl^?和PO?^3?）插层的LDH，并对其进行了表征。通过冷冻凝胶化和干燥制备了Alg/LDH气凝胶，并测定了它们的物理和化学性质。最后，通过用细胞培养液重新水化这些气凝胶，获得了3D细胞培养系统，从而能够体外评估Alg/LDH支架的细胞增殖、分化和分布能力。

实验部分

MgCl₂·6H₂O（Baker?）、AlCl₃·6H₂O（Anedra）、NaOH颗粒（PA级，Cicarelli）、37% w w^?1 HCl溶液（PA级，Cicarelli）、K₂HPO₄（PA级，Baker）、NaCl（PA级，Cicarelli）、NaHCO₃（PA级，Cicarelli）、KCl（PA级，Anedra）、CaCl₂·2H₂O（PA级，Anedra）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris缓冲液，PA级，Biopack）和Na₂SO₄（PA级，Baker）、NaH₂PO₄（PA级，Baker）、海藻酸钠（PuraQuimica）、96%乙醇（Porta）、抗坏血酸（PA级，Anedra）、β-甘油磷酸盐

LDH颗粒的表征

样品的结构表征表明，合成过程有效地产生了与选定阴离子插层的LDH相（图2）。因此，所有样品的PXRD图谱（图2a）显示了LDH相的特征峰。LDH-Cl样品显示了对应于（0 0?l）、（01l）和（11l）反射的带状谱线，这些谱线特征表明LDH中c?=?22.8??和a?=?3.04??（JCPDS文件编号19–0748）。其余阴离子的插层导致了

结论

通过将海藻酸盐气凝胶与无机颗粒（如与简单OSM插层的LDH）结合，获得了具有细胞分布、粘附、增殖能力和骨诱导特性的3D培养和组织工程支架。在所有情况下，都成功获得了与不同阴离子插层的LDH，尽管插层影响了药物负载、颗粒聚集或ζ电位等性质。LDH颗粒在Alg中均匀分散

CRediT作者贡献声明

Juan P. Zanín：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、数据管理。German Gil：验证、监督、研究、概念化。Ricardo Rojas：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了Gemini工具来修订文本中特定部分的英语用法。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Ricardo Rojas报告称获得了国家研究与创新机构的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

GG、JPZ和RR是CONICET的成员。感谢CONICET、ANPCyT（PICT2020-1781）、SeCyT-UNC和MinCyT-CBA提供的经济支持。感谢LAMARX-IFEG设施提供的SEM图像。感谢Marcelo R. Romero博士和Cesar Gomez在获取流变数据方面的合作。作者非常感谢科尔多瓦微纳科学中心（CEMINCO – CONICET – 大学）的技术和成像支持。