《Cellular Immunology》：WISP-3 enhances proinflammatory cytokine IL-1β production in rheumatoid arthritis through the FAK, JNK and AP-1 pathways
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类风湿关节炎（RA）中WISP-3通过激活FAK/JNK/c-Jun通路促进IL-1β表达，影响滑膜炎症和关节破坏。研究采用体外RA滑膜成纤维细胞模型，证实WISP-3剂量依赖性上调IL-1β mRNA和蛋白水平，并通过FAK介导的JNK/c-Jun信号通路增强其转录活性。抑制FAK、JNK或c-Jun均可显著阻断WISP-3诱导的IL-1β产生。该发现揭示了WISP-3在RA炎症中的新机制，为靶向FAK/JNK通路治疗RA提供依据。
侯胜茂|王国寿|郭正宏|刘春林|陈朝菊|唐志新|林志扬
台湾血液服务基金会研究部，台北100231，中国台湾
摘要
背景
类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是持续的滑膜炎症、进行性的关节破坏和长期的残疾。白细胞介素-1β（IL-1β）是一种关键的促炎细胞因子，在RA的发病机制中起重要作用。Wnt1诱导的信号通路蛋白3（WISP-3）与关节稳态和RA的发展有关，但WISP-3调节滑膜炎症的分子机制尚不完全清楚。
方法
在这项体外研究中，用人类RA滑膜成纤维细胞（RASFs）处理不同浓度的WISP-3，以评估IL-1β在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。使用药物抑制剂和siRNA介导的基因沉默技术研究了焦点粘附激酶（FAK）、c-Jun N末端激酶（JNK）和c-Jun信号通路的作用。通过评估蛋白质磷酸化和转录活性来阐明信号级联反应。
结果
WISP-3以剂量依赖的方式显著上调了IL-1β的表达。机制分析表明，WISP-3激活了FAK，进而诱导了JNK和c-Jun的磷酸化。这种信号级联反应增强了转录活性并促进了IL-1β的产生。通过选择性抑制剂或siRNA阻断FAK、JNK或c-Jun，显著降低了WISP-3诱导的IL-1β表达，证实了FAK/JNK/c-Jun轴在WISP-3诱导的IL-1β表达中起主要作用。
结论
这些体外研究结果表明，WISP-3通过激活FAK/JNK/c-Jun通路主要促进IL-1β的表达，同时其他信号通路也起到一定作用，从而在RA中发挥促炎作用。
引言
类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征是持续的滑膜炎症、进行性的关节破坏和不可逆的功能障碍[1]、[2]。滑膜成纤维细胞的异常增殖和激活是由免疫细胞、细胞因子和细胞外基质相关信号之间的复杂相互作用驱动的，在RA的发病机制中起着核心作用[3]、[4]。滑膜内促炎和抗炎介质的产生失调进一步放大了炎症级联反应，加速了软骨和骨骼的退化[5]、[6]。在这种情况下，RA滑膜成纤维细胞（RASFs）通过产生软骨溶解酶和促炎细胞因子来维持慢性滑膜炎和关节损伤[7]、[8]。因此，针对滑膜成纤维细胞介导的炎症信号传导的治疗策略仍然具有相当大的研究价值。
在RA患者中，血清和滑液中促炎因子水平升高。这些介质在疾病的病理生理过程中起着关键作用，导致慢性炎症和关节退化[9]、[10]。IL-1β是一种关键的炎症细胞因子，在RA的发病和进展中起着重要作用[11]。在接受半月板切除术的患者中，膝关节RA的放射学表现与滑液中IL-1β表达升高有关[12]。研究表明，IL-1β通过蛋白酶促进细胞外基质的破坏，从而促进关节疾病的发展[13]。由于RA滑膜组织中的IL-1β水平高于健康个体，因此开发了如卡纳单抗（canakinumab）等抑制IL-1β的疗法来治疗RA[14]。虽然针对致病细胞因子的生物制剂改良抗风湿药（bDMARDs）显著改善了治疗结果[15]，但并非所有患者都对这些疗法有良好的反应，许多人最终会出现反应减弱[2]。因此，显然需要进一步改进RA的治疗方法。
CCN家族包括六种基质细胞蛋白，它们在炎症、迁移和血管生成等主要病理生理过程中发挥着关键作用[16]。尽管像CTGF（CCN2）和WISP-1（CCN4）这样的家族成员因其在RA中的促炎和促纤维化作用而被广泛研究，但WISP-3（也称为CCN6）表现出不同的调控特性。与主要与TLR信号通路和软骨破坏相关的WISP-1不同，WISP-3被确定为骨骼发育的关键调节因子，其缺乏会导致进行性假性类风湿性发育不良（PPD），这是其他CCN蛋白所没有的特征[17]、[18]。在RA滑膜中，WISP-3的mRNA水平显著高于骨关节炎（OA）和健康滑膜组织。此外，研究表明促炎因子可上调RASFs中的WISP-3 mRNA表达[19]。有趣的是，RA和正常滑膜中的WISP-3蛋白水平相当，这表明WISP-3的mRNA和蛋白质调控可能存在不协调，这可能指向WISP-3特有的翻译后修饰或局部细胞外基质（ECM）的隔离[19]。值得注意的是，WISP-3在幼年特发性关节炎的进展中似乎也起着重要作用[20]。
与其他CCN成员相比，WISP-3在调节RA中促炎细胞因子IL-1β表达的作用尚未得到充分研究。我们的结果表明，WISP-3通过激活FAK/JNK/c-Jun通路促进RASFs中的IL-1β产生。虽然焦点粘附激酶（FAK）、c-Jun N末端激酶（JNK）和AP-1信号通路是一些CCN蛋白共有的炎症机制，但WISP-3/IL-1β轴的特异性参与为RA细胞因子网络的分层复杂性提供了新的见解。通过阐明这些信号相互作用，我们的研究增强了对RASF激活机制的理解。尽管需要进一步的体内验证来确认其系统性疗效，但WISP-3/IL-1β轴是一个值得进一步研究的潜在治疗候选靶点。
材料
抗IL-1β、FAK、JNK和c-Jun的抗体来自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州）。Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹弗斯）提供了p-FAK、p-JNK和p-c-Jun抗体。重组人WISP-3来自PeproTech（美国新泽西州罗基希尔）。FAK抑制剂（GSK2256098；目录号：HY-100498）、JNK抑制剂（SP600125；目录号：HY-12041）和AP-1抑制剂（T-5224；目录号：HY-12270）从MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯）购买。
WISP-3促进RASFs中的IL-1β产生
已有研究表明WISP-3在关节炎期间对软骨的生长和维持起作用[27]。我们研究了WISP-3在RASFs中促进IL-1β产生的作用。用WISP-3刺激RASFs显著增加了IL-1β的mRNA表达，但TNF-α、TGF-β1或IL-10的表达没有变化（图1A）。此外，通过qPCR、Western blot和ELISA检测，WISP-3以剂量依赖的方式增加了IL-1β的mRNA和蛋白质水平（图1B–E）。这些结果表明WISP-3诱导了IL-1β的产生
讨论
RA是一种慢性炎症性疾病，其特征是持续的滑膜炎症和进行性的关节破坏，最终导致不可逆的功能障碍[31]、[32]。滑膜成纤维细胞是这一过程中的关键效应细胞，因为它们产生促炎细胞因子，维持并放大局部炎症[33]。在本研究中，我们使用人类RA滑膜成纤维细胞来研究WISP-3在炎症信号传导中的作用。我们发现WISP-3显著
作者贡献声明
侯胜茂：资源、方法学、正式分析、数据管理。王国寿：资源、方法学、正式分析、数据管理。郭正宏：验证、研究、数据管理。刘春林：验证、研究、数据管理。陈朝菊：验证、数据管理。唐志新：撰写初稿、监督、资源提供。林志扬：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供、资金获取。资助
本工作得到了国家科学技术委员会（NSTC 113–2320-B-039-049-MY3；NSTC 114–2320-B-039-077-；NSTC 113–2314-B-341 -004；NSTC 114–2314-B-341 -007 -MY3）、中国医科大学医院（DMR-114-014；DMR-114-021）、中国医科大学（CMU114-ASIA-01）和信康吴侯纪念医院（2023SKHBDR005；2024SKHBDR004；2024SKHBND002）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢信康吴侯纪念医院的支持。图形摘要使用BioRender制作。
