《Industrial Crops and Products》：Transcriptome analysis reveals acetylsalicylic acid-mediated accumulation and regulatory network of piperine content in Piper nigrum L.roots
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黑胡椒（Piper nigrum L.）因其较高的胡椒碱含量而被广泛应用于食品和医药领域。然而，近期研究表明，胡椒碱的合成与积累同样发生于胡椒根中，这为胡椒碱的可持续生产提供了新的途径。乙酰水杨酸（ASA）作为一种植物信号分子，广泛参与植物次生代谢调控。然而，
黑胡椒（Piper nigrum L.）因其较高的胡椒碱含量而被广泛应用于食品和医药领域。然而，近期研究表明，胡椒碱的合成与积累同样发生于胡椒根中，这为胡椒碱的可持续生产提供了新的途径。乙酰水杨酸（ASA）作为一种植物信号分子，广泛参与植物次生代谢调控。然而，其是否调控胡椒根中胡椒碱的合成仍有待阐明。本研究评估了不同浓度外源ASA（0、50、100、200 μM）对胡椒根中胡椒碱含量的影响。结果发现，ASA以浓度依赖性方式调控胡椒碱积累，并在50 μM时达到峰值。基于RNA-seq（RNA测序）数据和加权基因共表达网络分析（WGCNA），进一步确定50 μM ASA处理可通过显著上调胡椒碱生物合成途径中的关键基因（如PnADT、PnCSS、PipBAHD1），促进根中胡椒碱积累。与此同时，ASA还重塑碳代谢流，调控糖代谢过程以及内源激素合成与信号转导通路，从而协同促进根系生长发育并扩展胡椒碱合成位点。本研究从多基因、多通路协同调控角度揭示了低浓度ASA通过双重机制增强胡椒碱含量的分子基础——即激活胡椒碱合成通路并促进根系发育。该研究为利用外源激素调控胡椒碱生产提供了理论支持。
该论文发表于《Industrial Crops and Products》，聚焦黑胡椒（Piper nigrum L.）根系中胡椒碱合成调控这一新近受到关注的研究方向。传统认识普遍认为胡椒碱主要在未成熟果实中合成和积累，因此围绕胡椒品质改良与胡椒碱增产的研究也多集中于果实组织。然而，近年来研究逐步表明，黑胡椒根部同样具有胡椒碱积累能力，且部分关键生物合成基因在根组织中存在可检测表达。这一发现意味着根系不仅是吸收与运输器官，也可能是重要的次生代谢场所，从而为胡椒碱可持续生产和黑胡椒品质定向调控提供了新的生物学基础。
在此背景下，当前仍存在几个关键问题：其一，根中胡椒碱积累是否可被外源调控因子有效诱导；其二，植物激素或激素衍生物是否通过特定代谢与信号网络调控根中胡椒碱生物合成；其三，这种调控是否具有剂量效应及其分子基础。乙酰水杨酸（ASA）作为水杨酸（SA）的可移动衍生物，兼具较好的稳定性与生物活性，已被用于调节植物品质和次生代谢能力，但其对黑胡椒根中胡椒碱合成的作用机制尚不清楚。基于此，研究人员以“热研1号”黑胡椒幼苗为材料，系统考察不同浓度ASA处理对根系形态和胡椒碱积累的影响，并结合转录组分析与加权基因共表达网络分析（WGCNA）解析其调控机制。
研究的总体结论表明，ASA对黑胡椒根中胡椒碱积累具有显著的浓度依赖性调控作用，呈现典型的“低浓度促进、高浓度削弱”效应，其中50 μM处理效果最佳。低浓度ASA一方面通过上调胡椒碱生物合成关键基因，直接增强胡椒碱合成能力；另一方面通过重塑碳代谢流、调节糖代谢及内源激素合成与信号转导，促进根系发育并扩大胡椒碱潜在合成位点。该研究的重要意义在于，不仅从根组织层面拓展了对黑胡椒胡椒碱代谢空间分布的认识，也为利用外源激素诱导提高胡椒碱含量提供了理论依据，并为高胡椒碱品种分子育种提供了候选基因资源。
研究人员采用的主要技术方法包括：以中国热带农业科学院香料饮料研究所来源的“热研1号”黑胡椒种子培育幼苗，设置0、50、100、200 μM ASA处理7 d，测定根长、根表面积、根尖数、干重及胡椒碱含量；采用高效液相色谱（HPLC）定量胡椒碱；对0、50、100 μM处理根样进行RNA-seq（RNA测序）并利用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs）；进一步采用WGCNA、Mfuzz软聚类和KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析挖掘与表型相关的功能模块和通路；检测内源SA含量，并以qRT-PCR对关键基因表达进行验证。
3.1. Exogenous ASA influenced pepper root morphology and piperine content
研究首先从表型层面评估ASA处理效应。结果显示，根中胡椒碱含量随ASA浓度升高呈先升后降趋势，在50 μM时达到最高，而200 μM与对照相比无显著差异，说明低浓度ASA显著促进胡椒碱积累，但高浓度会削弱这种促进作用。根系性状方面，根长、根表面积和根尖数也表现出相似的先升后降模式，仅50 μM处理达到显著促进水平；根干重虽在低、高浓度处理下均增加，但与ASA浓度相关性不强。Mantel检验和随机森林分析进一步表明，胡椒碱含量与根系形态性状显著相关，其中根尖数对ASA浓度差异响应最强。该部分结果说明，低浓度ASA可同步促进根系建成与胡椒碱积累，二者可能存在生理耦联关系。
3.2. Differential analysis and WGCNA analysis synergistically screened phenotypically associated differentially expressed genes
由于200 μM处理未表现出促进效应，研究人员选择0、50、100 μM三个处理进行转录组分析，以解析低浓度促进和较高浓度削弱效应背后的分子基础。差异表达分析显示，CK与ASA50之间、ASA50与ASA100之间分别检测到大量DEGs，并筛得655个在两组比较中共同差异表达的基因，其中部分基因在50 μM下上调而在100 μM下回落，或相反，表达模式与表型变化趋势一致。WGCNA进一步将这些DEGs划分为14个共表达模块。模块-性状相关分析表明，多个模块分别与胡椒碱含量和根系形态显著相关，且部分与胡椒碱相关的模块同时也与根系性状相关。这说明ASA诱导的胡椒碱合成增强与根系生长促进在转录组层面并非独立过程，而是共享部分关键调控节点。
3.3. Analysis of co-expression patterns and enrichment analysis of concentration-dependent differentially expressed genes
为揭示浓度依赖性效应对应的动态表达规律，研究人员对与胡椒碱含量及根系性状显著相关的DEGs进行Mfuzz软聚类，获得8个表达簇。结果显示，部分与胡椒碱相关和与根系性状相关的基因簇均呈现“50 μM上升、100 μM回落”的模式，与表型变化高度一致。KEGG富集分析表明，这些基因显著富集于次生代谢生物合成、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、黄酮生物合成等通路。该结果表明，ASA诱导的胡椒碱积累与根生长促进在代谢层面存在较大重叠，尤其集中于碳代谢、次生代谢与激素调控网络的协同重构。
3.4. Changes in gene expression within the piperine synthesis pathway
围绕胡椒碱生物合成途径，研究人员重点分析了相关DEGs的表达变化。结果表明，低浓度ASA可增强三羧酸循环（TCA，tricarboxylic acid cycle）相关过程，提高草酰乙酸供应，并为莽草酸途径提供更多磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。在此基础上，PnTAT与PnADT等关键基因上调，促进相关前体向对羟基肉桂酸方向转化；随后PnCAD、PnCSS等基因参与将前体进一步转化为胡椒酰辅酶A（piperoyl-CoA）；同时PipBAHD1上调，增强胡椒酰辅酶A与胡椒啶缩合，最终促进胡椒碱积累。与之相对，高浓度ASA下，多数在低浓度时被激活的关键基因表达下降，从而削弱促进效应。研究还观察到PnglgC上调，提示ASA可能促进直链淀粉合成。文中结合既有体外研究提出，直链淀粉可能通过与胡椒碱形成复合物提升其稳定性。另一方面，由于SA与胡椒碱在上游前体供应上存在交叉，且ASA处理后内源SA含量下降、PnPR1表达下调，研究结果为SA途径与胡椒碱途径之间可能存在代谢竞争提供了初步证据。
3.5. Low-concentration ASA promotes root growth via glycometabolism-hormone crosstalk
在根系发育调控方面，研究人员提出低浓度ASA通过“糖代谢—激素”串扰促进根生长。具体而言，G1P向ADP-葡萄糖转化增强，配合PnGBE1等基因上调，有利于淀粉合成；同时蔗糖降解减少，导致淀粉和蔗糖积累，为根生长提供碳骨架和能量来源。进一步地，糖代谢中间产物PEP进入色氨酸及生长素（IAA）合成相关过程，IAA信号增强后，通过TIR1/AFB受体复合体介导AUX/IAA抑制解除，释放生长素响应因子（ARFs），并激活PnSAUR、PnGH3等下游基因，促进侧根形成。与此同时，PEP经丙酮酸和甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径生成共同前体DMAPP，进而关联细胞分裂素（CK）和油菜素内酯（BR）合成。低浓度ASA显著下调PnCYP735A，抑制CK合成，相对有利于BR作用发挥。由于CK对主根伸长和侧根发育存在抑制或拮抗影响，其降低可缓解对IAA和BR促根效应的制约。最终，根系尤其是根尖数量增加，被认为扩展了胡椒碱合成的有效空间位点。
3.6. Co-expression network analysis of core genes in piperine synthesis and root growth promotion pathways
为进一步明确胡椒碱合成与根生长促进通路之间的联系，研究人员构建了关键基因共表达网络。结果显示，在胡椒碱合成通路内部，上游至对羟基肉桂酸形成阶段的基因模块与其他模块相关性较强；在根系生长相关路径中，激素合成与信号转导模块同淀粉和蔗糖代谢模块之间也存在显著相关关系。更重要的是，胡椒碱合成通路与根生长通路之间同样形成可辨识的相关网络，尤其是胡椒碱合成前段与根生长激素信号模块之间关联明显。这支持了前述结论，即ASA并非仅直接刺激某一条代谢支路，而是通过多通路联动实现胡椒碱积累与根系发育的协同促进。qRT-PCR对5个关键基因的验证结果与转录组表达趋势一致，说明RNA-seq数据可靠。
讨论部分围绕三个核心层面展开。首先，研究人员指出，ASA对胡椒碱合成的调控具有明显的剂量依赖性，低浓度促进而较高浓度削弱，这与植物次生代谢中常见的双相效应一致。转录组结果表明，该效应的直接分子基础在于低浓度ASA激活了莽草酸途径及胡椒碱特异合成途径中的多个关键节点，而较高浓度则使这些关键基因表达回落。其次，研究强调ASA对胡椒碱积累的促进并不仅限于直接代谢调控，还通过重塑碳代谢网络、改变糖储备和激素环境，优化根系结构，进而间接扩大胡椒碱合成能力。特别是根尖数增加，可能意味着更多活跃合成位点。再次，研究讨论了SA与胡椒碱合成之间潜在的资源竞争关系。由于两条途径共享上游代谢前体，且ASA处理后内源SA水平下降、SA响应基因受抑，说明外源ASA诱导下植物可能发生代谢重编程，将资源更多分配至胡椒碱合成途径。不过，文中同时指出，这一竞争关系目前仅获得初步支持，尚需进一步直接验证。
研究结论部分可译为：本研究系统阐明了外源ASA如何通过浓度依赖性的双重机制调控胡椒碱生物合成。首先，ASA通过上调莽草酸途径和胡椒碱特异合成途径中的关键基因，为胡椒碱积累提供基础驱动力；其次，ASA通过优化根系构型扩展胡椒碱合成位点，并可能通过促进直链淀粉合成增强其稳定性。此外，研究结果揭示，ASA诱导的代谢重编程可能引发SA防御信号与胡椒碱合成之间的资源竞争。本研究不仅为将ASA作为诱导剂应用于黑胡椒品质改良提供了有力理论支持，也鉴定出根中胡椒碱合成相关关键基因，可作为高胡椒碱品种分子育种的候选靶标。
