生存策略：一项关于非分型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）通过底物结合蛋白SapA介导的防御机制以抵抗人类抗菌肽的研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：Survival tactics: A study on the substrate-binding protein SapA-mediated defense mechanism of non-typeable Haemophilus influenzae against human antimicrobial peptides

非致病性流感嗜血杆菌（NTHi）通过Sap转运蛋白摄取并降解人类抗菌肽（hAMPs），抵抗宿主免疫。本研究利用分子对接和动态模拟，发现HiSapA可结合hBD-2、hBD-3、hNP-1、hNP-4和hLL-37五种hAMPs，结合能量-24.03至-78.55 kcal·mol?1。关键序列 motifs（如hBD-2的RRYKQ）和结合口袋体积扩大（823 ?3→2095 ?3）提示其“捕蝇草”机制，为靶向药物设计提供依据。

　　

Kalyan Ghosh | Pratik Dasgupta | Shankar Prasad Kanaujia

印度古瓦哈提印度理工学院生物科学与生物工程系，古瓦哈提，781039，阿萨姆邦，印度

摘要

非分型流感嗜血杆菌（NTHi）是一种机会性病原体，可引起多种呼吸道疾病。它利用Sap（抗菌肽敏感性）转运蛋白来对抗人体抗菌肽（hAMPs）。在流感嗜血杆菌中，Sap系统由六个亚基组成，即SapABCDFZ，类似于典型的ATP结合盒（ABC）导入蛋白。亚基HiSapA在底物结合中起作用，据报道它可以捕获如LL-37和β-防御素等hAMPs。然而，HiSapA的底物类型及其结合机制尚未完全了解。本研究尝试通过计算机模拟方法填补这些空白。研究结果表明，五种hAMPs（hBD-2、hBD-3、hNP-1、hNP-4和hLL-37）可以与HiSapA结合，结合能范围为?24.03至?78.55 kcal mol^?1。此外，hAMPs中存在的特定序列基序（hBD-2的RRYKQ、hBD-3的PKEEQ、hNP-1的RRYGT、hNP-4的RLVFCR和hLL-37的LGDFFR）对HiSapA的相互作用至关重要。此外，对结合位点口袋构象变化和体积变化的分析表明，当hAMPs与HiSapA结合时，其体积从823 ?³增加到2095 ?³，表明其结合机制与之前提出的ABC导入蛋白的“捕蝇草”机制类似。总之，本研究的结果可用于基于结构的药物开发。

引言

非分型流感嗜血杆菌（NTHi）是一种革兰氏阴性机会性病原体，是中耳炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、急性鼻窦炎和肺炎的致病菌[1]。人体细胞对抗细菌病原体的先天免疫机制之一是产生抗菌肽（hAMPs）[2]。hAMPs通过破坏细菌细胞膜来抑制其生长[3]。hAMPs主要分为防御素和cathelicidins两类[4]。大多数hAMPs是带正电荷的两亲性肽，长度约为20–50个氨基酸[5]、[6]。属于防御素的hAMPs富含半胱氨酸氨基酸，并具有三个分子内二硫键，形成一个保守的γ-核心结构，由反平行β链组成[5]、[7]。如α-防御素-1（hNP-1）、β-防御素-2（hBD-2）、β-防御素-3（hBD-3）等防御素在人类呼吸系统黏膜表面的上皮细胞中尤为突出[8]、[9]、[10]。hAMP LL-37是cathelicidin家族的唯一成员，由包括气道细胞在内的多种细胞产生，在人体免疫系统中起重要作用[6]、[11]。另一方面，细菌病原体也进化出了对抗这些宿主产生的物质（如hAMPs）的策略[12]。细菌病原体采用的抗性机制包括改变细胞膜、抑制hAMPs的产生、掩盖细胞表面、降解hAMPs以及将hAMPs转运穿过细胞膜等[12]。

在NTHi中，对hAMPs的抗性是通过Sap（抗菌肽敏感性）转运蛋白介导的。该独特系统通过ABC转运蛋白将hAMPs导入细胞，该转运蛋白由底物结合蛋白HiSapA、跨膜结构域HiSapBC、核苷酸结合结构域HiSapDF和一个额外的成分HiSapZ组成，随后由细胞质蛋白酶降解[13]。这种机制并非NTHi所独有；早期研究表明，Sap转运蛋白的类似物在沙门氏菌中可抵抗protamine，在奇异变形杆菌中可抵抗protegrin-1[14]。

尽管文献中报道了Sap系统在hAMPs摄取中的作用，但其与转运蛋白之间的结构细节仍不明确。本研究通过蛋白质-蛋白质对接计算确定了HiSap系统的SBP成分HiSapA与hAMPs之间的相互作用。结果表明HiSapA具有多特异性，可以结合多种hAMPs。进一步通过分子动力学模拟验证了HiSapA•hAMP复合物。基于本研究的结果，提出了一种可能的底物结合和转运机制。总体而言，这些发现不仅提供了关于hAMPs与Sap系统相互作用的深入结构见解，还为设计针对流感嗜血杆菌等病原体的治疗方法提供了途径。

数据收集与结构分析

包含不同抗菌肽（AMPs）的肽数据集来源于多个数据库，包括抗菌肽数据库（APD）、抗菌序列数据库（DAMPD）、抗菌肽数据仓库（DRAMP）和抗菌肽集合（CAMP）[16]、[17]、[18]、[19]。HiSapA（PDB id: 8TV8）和全长hAMPs（hBD-2，PDB id: 1FD3；hBD-3，PDB id: 1KJ6；hNP-1，PDB id: 3GNY）的三维原子坐标

hAMPs具有与HiSapA相互作用所需的特定基序

先前已有报道表明HiSapA可以与多种hAMPs片段相互作用，例如hBD-2、hBD-3和hNP-1（PDB id: 8TV8）[22]。因此，这些hAMPs片段被用作阳性对照来验证蛋白质-蛋白质对接协议。结果确认hBD-2（RRYKQ）、hBD-3（PKEEQ）和hNP-1（RRYGT）片段与HiSapA结合位点的对接（图S1A）。hBD-2的RRYKQ片段与HiSapA的结合得分为?1921.1（表

讨论

非分型流感嗜血杆菌（NTHi）是一种革兰氏阴性机会性病原体，因其与中耳感染、肺炎、慢性阻塞性肺病（COPD）等多种呼吸道疾病的频繁关联而成为重要问题[1]。作为对此类感染的响应，人体会释放抗菌肽（hAMPs）作为第一道防线，这些肽能有效攻击细菌细胞膜[45]。

结论

本研究揭示了hAMPs与HiSapA结合的结构机制。结果通过多种计算机模拟方法得到了验证。蛋白质-蛋白质分子对接研究用于评估hAMPs（hBD-2、hBD-3、hNP-1、hNP-4和hLL-37）与HiSapA的结合情况。此外，五种不同HiSapA•hAMPs复合物的分子动力学模拟显示了有利的结合能，以及影响Hi构象变化的结构决定因素

CRediT作者贡献声明

Kalyan Ghosh：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理。Pratik Dasgupta：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、正式分析、数据管理。Shankar Prasad Kanaujia：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。

出版同意

所有作者同意发表该手稿。

未引用的参考文献

[15]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究部分得到了印度政府生物技术部（DBT）（资助编号：BT/PR42098/BRB/10/1981/2021）的支持。作者感谢Param-Ishan、Param-Kamrupa以及印度理工学院古瓦哈提分校（IITG）的生物科学与生物工程系（BSBE）提供的计算资源。KG感谢总理研究奖学金（PMRF）提供的研究资助。