《International Journal of Biological Macromolecules》：WOX11 antisense construct as a functional tool to regulate root growth and volatile compound biosynthesis in Aquilaria sinensis
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沉香根发育及次生代谢调控机制研究：通过合成WOX11 antisense转录本编码肽（anti-AsWOX11），发现其显著促进沉香气生根形成，并调控挥发性代谢物合成，首次揭示该肽对根发育和萜类生物合成的双重调控作用，为分子育种提供新依据。
李天晓|张林凡|张展玲|乔立超|高家琦|张世一|李翔|尹亚芳|刘娟
中国中医科学院中药资源中心道地药材质量保证与可持续利用国家重点实验室，北京，100700，中国
摘要
尽管WUSCHEL相关同源框（WOX）11介导的不定根生长调控机制已经较为明确，但其反义转录本的功能意义尚未完全阐明。Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg是一种富含树脂的芳香木材，具有重要的商业价值，是生产沉香的关键植物资源。
目的
研究反义WOX11（一种由WOX11衍生的反义转录本）在A. sinensis根系发育和挥发性化合物生物合成中的功能作用。
方法
使用转基因A. sinensis品系和Arabidopsis thaliana来合成并评估anti-AsWOX11
主要发现
anti-AsWOX11显著促进了A. sinensis的不定根生长；转录组和蛋白质组分析表明它调节了激素信号传导和根系发育调控网络；anti-AsWOX11还调节了挥发性代谢物的合成，诱导产生了新的成分α-古军烯和α-雪松烯。
结论
反义WOX11作为根系发育和次生代谢的促进因子，为反义转录本的功能提供了新的见解，并为A. sinensis的分子育种和资源利用提供了理论基础。
引言
沉香是一种具有独特香气和治疗特性的珍贵产品，它是在Aquilaria和Gyrinops物种的茎、枝和根受到生物（真菌）或非生物损伤后通过创伤性树脂生成形成的[1]。由于其天然资源稀缺且商业价值巨大，沉香在全球具有重要的经济和文化意义，广泛用于香水、香料、传统医药和宗教仪式中[2]、[3]。在传统医学中，沉香表现出多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗炎作用[4]、[5]、[6]、[7]。全球沉香市场的年价值超过数十亿美元，优质沉香的售价甚至高于黄金，最纯的沉香油在全球市场上的价格约为25,000美元/千克[8]。然而，沉香树木中的天然树脂生成是一个漫长的过程，在非诱导的自然条件下通常需要数十年才能积累足够的倍半萜类化合物[9]。因此，Aquilaria属植物在中国及印度、越南、印度尼西亚、马来西亚和泰国等南亚和东南亚国家备受重视，沉香种植园的建立呈增长趋势[10]、[11]。尽管种植面积不断扩大，但Aquilaria的的无性繁殖仍然具有挑战性，主要是因为其不定根形成能力较弱，并且随着树龄的增长而减弱[12]。沉香根含有树脂和多种生物活性植物化学物质，已被商业应用于香水及制药领域[13]。此外，不定根培养已被证明是获取药用植物中有价值次生代谢物的有效途径[14]。因此，高效诱导不定根的形成不仅是对Aquilaria无性繁殖成功的关键瓶颈，也是促进沉香产业可持续发展的迫切需求。
生物技术的最新进展和新技术（包括基因编辑、组织培养和诱导技术）为高效繁殖优质沉香种质提供了新的途径[15]、[16]、[17]。其中，调控根系发育的转录因子成为特别有前景的研究方向。WUSCHEL相关同源框（WOX）转录因子家族，尤其是WOX11，因其在中枢根形成中的作用而被广泛研究[18]、[19]、[20]，它协调激素信号传导并调节下游基因表达[21]、[22]、[23]。据报道，在Betula platyphylla中，BpWOX11可以增强桦树插条的不定根形成[24]，而在杨树中，PeWOX11可以诱导异位根的形成[25]。尽管WOX11在易于生根的物种（如桦树和杨树）中的作用已被报道[24]、[26]，但在难生根物种中的作用仍大多未被探索[27]、[28]。迄今为止，WOX11在A. sinensis中的功能尚未有研究报道。鉴于WOX11在根系结构中的核心作用，以及先前的研究发现表明天然反义转录本（如lncWOX11）能够有效抑制WOX11的表达从而抑制不定根形成[29]，天然反义转录本（NATs）逐渐被认为是植物基因表达的重要调节因子。它们可能通过转录干扰、影响转录稳定性的RNA双链形成或染色质状态的表观遗传调控来发挥作用[30]。最近的研究进一步表明，某些非典型转录本包含能够编码生物活性肽的小开放阅读框（sORFs），从而扩展了植物基因组的功能复杂性[31]、[32]。然而，反义转录本衍生的肽的生物学意义仍大部分未被探索，尤其是在Aquilaria sinensis等木本植物中。因此，探索反义转录本衍生的肽是否具有生物活性肽的功能可能为基因调控复杂性和植物发育可塑性提供新的见解。先前有研究观察到WOX11在A. sinensis中能促进不定根的形成。然而，反义WOX11片段在A. sinensis根系发育和沉香形成过程中的作用仍大多未被探索。
本研究鉴定出一种来自AsWOX11反义转录本的短片段，并将其编码的肽命名为anti-AsWOX11。该片段经过化学合成后作为独立表达单元进行功能评估。值得注意的是，本研究未探讨RNA-RNA相互作用介导的转录后调控机制，而是评估了该肽在调节根系发育和次生代谢方面的生物活性。与内源性lncWOX11不同[29]（已知其在RNA水平上调节WOX11表达），anti-AsWOX11是一种由反义片段工程化得到的肽。结果表明，这种肽对根系形态发生具有促进作用，并改变了挥发性代谢物的组成。这是首次针对A. sinensis中WOX11的功能性反义研究，为理解其调控途径提供了新的见解。此外，成功工程化和验证anti-AsWOX11为改善沉香物种的根系特性和调节次生代谢提供了新的分子工具和理论基础。
部分内容摘要
Aquilaria sinensis
2020年6月果实期，从广州非物质文化遗产保护公园获取了A. sinensis的种子。经过表面灭菌后，将种子置于无激素的Murashige和Skoog（MS）基础培养基（30 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，pH=5.8）中（Phyto Tech，美国）。
Arabidopsis thaliana
将经过春化的Arabidopsis thaliana种子置于无菌环境中，并在无激素的1/2 MS基础培养基上培养，培养基用3 M胶带密封。anti-AsWOX11的理化性质
序列比对和系统发育分析证实，AsWOX11与Arabidopsis thaliana中的WOX11同源（图S1和S2），支持使用Arabidopsis作为功能研究的模型。将五种合成肽片段外源施用于Arabidopsis幼苗以筛选其反义活性。表型观察和根伸长区的纵向切片显示，其中一种片段显著促进了根伸长（图S3和S4）。讨论
Aquilaria sinensis是沉香的主要来源，由于其在传统中药、香料和香水生产中的应用，具有重要的经济和文化价值[50]。然而，A. sinensis的天然稀缺性和濒危状态凸显了改进栽培技术的迫切需求。在经济价值较高的木本植物（包括A. sinensis）的无性繁殖过程中，不定根的形成受到多种复杂因素的精细调控
结论
本研究通过鉴定anti-AsWOX11这一新的分子调节因子，为A. sinensis中不定根形成和倍半萜类化合物生物合成提供了新的见解（图8）。与以往的研究相比，本工作首次使用了WOX11的反义片段，并揭示了其在根系发育和次生代谢调节中的关键作用。这一发现不仅扩展了WOX11在根器官发生中的功能范围，还为
CRediT作者贡献声明
李天晓：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，数据管理。张林凡：撰写——初稿。张展玲：验证，研究。乔立超：数据管理，概念设计。高家琦：数据管理。张世一：验证。李翔：数据管理。尹亚芳：项目管理，概念设计。刘娟：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念设计。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT-3.5来提高语言表达和可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中央公益性研究机构基本研究基金（项目编号：ZZXT2023009、ZZ13-YQ-093）和CACMS创新基金（CI2025E00-14、CI2025G00-06）的支持。
