《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural insights into the evolution of alpha/beta-hydrolase fold luciferases
编辑推荐：
ABH超家族酶的进化适应性研究：解析双功能酶DhaA 238Loc的晶体结构与动力学机制，揭示从卤代烃去卤化酶到氧依赖荧光酶的功能转变关键结构特征及氨基酸位点。
玛丽卡·马耶罗娃（Marika Majerova）|亚娜·霍拉科娃（Jana Horackova）|卡罗琳娜·塞德拉克科娃（Karolina Sedlackova）|玛丽·苏洛娃（Marie Sulova）|大卫·科瓦尔（David Kovar）|吉里·丹博尔斯基（Jiri Damborsky）|兹比内克·普罗科普（Zbynek Prokop）|大卫·贝德纳尔（David Bednar）|马丁·马雷克（Martin Marek）
洛施米特实验室（Loschmidt Laboratories），马萨里克大学（Masaryk University）理学院实验生物学系及RECETOX项目，C13号楼，卡梅尼采5号，62500，布尔诺，捷克共和国
摘要
α/β-水解酶（ABH）超家族是一类分布广泛且功能多样的蛋白质结构，以其能够适应所有生命域中的多种分子功能而闻名。其中一个进化适应的显著例子是卤代烷脱卤酶家族获得了氧解发光酶反应的能力。这一进化的分子细节仍然令人困惑。在这项研究中，我们确定了这种双功能祖先ABH结构酶的晶体结构，并探讨了其动态行为，重点分析了从水解催化向氧解催化转变相关的分子特征。结构显示该酶具有典型的αβα三明治结构，中间夹着一个螺旋帽结构域。催化口袋足够大，可以容纳较大的底物。分子动力学模拟表明，共焦藻红素（coelenterazine）的进入并不构成主要的能量障碍，并确定了对氧解催化至关重要的结合取向。通过比较祖先酶和现存酶，我们发现了氧解发光酶特有的氨基酸和序列基序。总体而言，我们的结果为ABH结构酶的进化过程提供了更全面的了解——这些酶最初利用水来断裂化学键，后来逐渐适应利用氧气进行生物发光。
引言
α/β-水解酶（ABH）结构是一种结构上具有高度适应性的支架，能够支持多种催化功能，包括水解脱卤和氧化生物发光。尽管卤代烷脱卤酶（HLDs）[1]、[2]、[3]以及Renilla型发光酶[4]、[5]在化学性质和底物特异性上存在显著差异，但它们都基于相同的ABH结构。因此，ABH结构不仅成为研究新酶功能的理想模板，也是开发旨在扩展酶功能、稳定性和催化效率的蛋白质工程平台的理想基础。
据认为，发光酶活性从脱卤酶结构进化而来涉及结构特征的适应，尤其是在帽结构域和底物结合通道中，以适应体积更大、更疏水的共焦藻红素（CTZ）底物，并促进光子发射[6]、[7]。祖先序列重建（ASR）技术的进步使得能够重建和改造这类蛋白质，为生物技术应用提供了进化中间体的快照和多功能模板[6]、[8]。最近发现的第一种同时具有发光酶和HLD活性的酶进一步支持了发光酶起源于脱卤酶类祖先的假设[9]。
在祖先序列中，如AncHLD-RLuc [6]及其工程变体AncINS [7]等双功能酶已被研究，因为它们能够催化脱卤和生物发光反应。这些蛋白质为解析功能分化的分子基础以及合理设计催化效率和稳定性提供了独特的机会。另一种祖先蛋白DhaA 238Loc在保持脱卤酶功能的同时，其发光酶活性得到了显著增强[10]。尽管DhaA 238Loc与先前报道的AncHLD-RLuc有72.9%的氨基酸同源性（84.4%的相似性），但其发光强度提高了4.8倍，但导致这一改进的结构决定因素尚未明确。理解活性位点和芳香核配置如何促进从脱卤酶到发光酶的催化转变，不仅对于阐明酶的进化过程至关重要，也有助于开发改进的发光酶报告分子，用于成像、诊断和生物传感。
在这项研究中，我们确定了双功能祖先酶DhaA 238Loc的晶体结构，该酶能够催化水解脱卤和氧解发光反应，并且性能有所提升。通过全面比较祖先酶和现存ABH结构酶的结构和动态特性，我们试图识别和绘制出驱动该结构酶获得氧解发光反应的关键残基和分子元素。此外，我们还发现了区分发光酶活性酶与原始水解HLDs的残基级适应性差异（见图1）。通过明确这些结构决定因素，我们希望加深对酶适应机制的理解，为未来的工程改进提供依据，并推动增强型发光工具的开发。
实验方法
DNA突变
我们制备了DhaA 238Loc的四点突变体，其突变位点为V146I/V147R/S145F/H142C，简称为DhaA 238LocMut。这些突变是基于模板基因进行的。突变采用MegaPrimer聚合酶链反应（PCR）技术[11]实现，正向引物为5’-GATCGTGTTAAAGCAATTGTTTGCATGGAATTTATTCGTCAGCCGATTCGTAGCTGGGAAACCTG-3’，反向引物为5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
蛋白质结晶结果
我们的生产和纯化过程获得了高纯度且正确折叠的DhaA 238Loc蛋白，其热稳定性很高（Tm = 70.5 ± 0.03 °C），适合进行结晶筛选（见图2）。虽然许多晶体衍射质量较差，但两种属于不同空间群的晶体（C121和P21212）获得了高分辨率数据（表S4）。两个最终模型中的不对称单元各包含两个酶分子。选择C121结构进行进一步分析，因为
讨论
在这项研究中，我们提供了关于双功能祖先酶DhaA 238Loc的结构和动态信息，该酶具有双重脱卤和发光酶催化能力。DhaA 238Loc采用了典型的ABH结构，这种结构同时存在于HLDs和Renilla型发光酶中。它具有由α螺旋包围的中央β折叠层，以及形成一个大型活性位点的帽结构域。来自结晶母液的PEG分子结合在蛋白质的活性腔内，这一特征进一步说明了
CRediT作者贡献声明
玛丽卡·马耶罗娃（Marika Majerova）：撰写原始草稿、数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
亚娜·霍拉科娃（Jana Horackova）：撰写原始草稿、数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
卡罗琳娜·塞德拉克科娃（Karolina Sedlackova）：方法学设计、实验研究。
玛丽·苏洛娃（Marie Sulova）：方法学设计、实验研究。
大卫·科瓦尔（David Kovar）：方法学设计、实验研究。
吉里·丹博尔斯基（Jiri Damborsky）：结果验证、项目监督、资金筹集及概念构思。
兹比内克·普罗科普（Zbynek Prokop）：项目监督及资源提供。
未引用参考文献
[44]
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢捷克教育、青年与体育部（TEAMING CZ – CZ.02.01.01/00/23_029/0008437-, EXCELES Neuro - LX22NPO5107, ESFRI RECETOX - LM2023069）和捷克科学基金会（GA22-09853S和GX25-17329×）的支持。该项目获得了欧盟“地平线2020”（Horizon 2020）研究与创新计划（项目编号：857560）以及欧盟卓越中心CLARA（项目编号：101136607）的资助。
