《Frontiers in Immunology》：Reprogramming CAR T cells across genetic, epigenetic, metabolic and microenvironmental axes to improve efficacy and safety in cancer and autoimmune disease
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这篇综述聚焦CAR T细胞疗法，指出其在实体瘤和自身免疫病中的应用仍受制于抗原特异性不足、浸润不佳、慢性刺激下功能耗竭及毒性炎症综合征等问题。文章主张不应孤立地进行单一层面（如强化信号、敲除检查点、恒定细胞因子装甲）的优化，因为这常导致一种失败模式被另一种所取代。相反，作者提出一种“以失败模式驱动”的严谨设计框架，强调通过可编程抗原逻辑与可滴定激活、保留可再生功能状态的表观遗传编程、生理应激下的代谢重构以及微环境感知策略等多轴协同重编程，是同步提升疗效与安全性的可靠路径。
2 遗传重编程：从更强的信号到更智能的CAR控制
CAR设计常被视为对“更强活化”的追求，但不受控的活化是导致耗竭和毒性的直接路径。CAR的胞外结合区、铰链区和跨膜区影响免疫突触的几何结构、抗原敏感性和本底信号；而胞内结构域不仅决定即时的杀伤能力，也决定了细胞的分化轨迹。共刺激模块编码了生物学偏好：基于CD28的CAR通常驱动快速的效应分化与细胞因子产生，而基于4-1BB的CAR则倾向于促进持久性和线粒体适应性，这对疗效和炎症风险均有影响。
信号调谐正转向模块化控制而非简单的“开/关”。下一代CAR工程强调对铰链/跨膜区组成、免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的数量/位置以及替代性共刺激结构域（如ICOS、OX40）的系统性优化，以减少本底信号并重塑细胞因子谱。改进的标准不应是在饱和抗原条件下的体外杀伤，而应是在生理性抗原密度和组织应激下获得更优的“疗效-安全性”比。
靶向基因组整合使表达本身成为一个可工程化的变量。将CAR构建体插入特定基因座（如T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座）可以标准化表达、减少本底信号，并相比随机病毒整合提高抗肿瘤活性。对于通用型“现货”产品，多重编辑可破坏内源性T细胞受体(TCR)以降低移植物抗宿主病风险，同时其他编辑可减轻宿主排斥；但每增加一个编辑都会提升制造复杂性，并与宿主免疫系统产生新的、难以预测的交互作用。最新的碱基编辑策略值得关注，因其可在进行多重基因敲除时降低双链断裂负担，这对于需要同时进行多次编辑的通用型产品颇具吸引力。一个最近的例子是2025年一项靶向EGFR的通用型CAR T平台，它整合了针对CD3E、B2M、CIITA、ADORA2A、PDCD1和TGFBR2的六重工程化修饰，以限制同种异体反应性并抵抗实体瘤中的生化和免疫抑制。重要的是，该研究采用了腺嘌呤碱基编辑与CRISPR-Cas12b核酸酶工程相结合的混合多重基因编辑策略。因此，其主要启示并非复杂的通用型制造现已完全避免双链断裂，而是碱基编辑为多重敲除步骤提供了降低基因组扰动的方法，从而能够实现对抗肿瘤微环境的更宏大抵抗计划。
逻辑门控与可滴定回路是实现更安全效力的最清晰路径，尤其适用于实体瘤以及与必需免疫区室共享的自身免疫靶点。与门系统（双CAR或synNotch→CAR级联）需要两种抗原才能完全激活，从而减少在仅表达一种抗原的健康组织中的活性。在机制上，这些系统并不完全等同。在分裂识别双CAR设计中，一个受体传递CD3ζ信号，另一个提供共刺激，因此完全活化依赖于两种抗原的共同遭遇。synNotch→CAR级联则增加了一个转录检查点：识别抗原A可诱导针对抗原B的CAR重新表达，从而将细胞毒性限制在具有正确抗原背景的组织中。这种逻辑既可用于提高组合特异性，也可用于施加抗原密度过滤器，正如在能区分高表达HER2肿瘤与低表达HER2正常组织的synNotch回路中所展示的那样。最近的实例还将synNotch程序扩展到CAR诱导本身之外，包括仅在遭遇肿瘤后才许可局部细胞外基质降解的回路，从而在避免组成性基质重塑的同时改善浸润。因此，与门系统的关键价值并非单纯更强的功能，而是更宽的治疗窗口；其代价是激活延迟、抗原顺序依赖性，以及当任一抗原具有异质性或丢失时可能产生新的逃逸途径。非门（抑制性CAR）可将“受保护”抗原的识别转化为显性抑制。小分子门控的分裂CAR和开启开关平台则允许临床医生滴定活性，并可能实现“脉冲”式治疗而非不可控的持续存在。这些工具解决了实体瘤和自身免疫病共同面临的核心临床限制：治疗窗口。
安全开关应成为追求高风险靶点或叠加效力编辑时的标准配置。诱导型半胱天冬酶-9(iCasp9)是经过临床验证的“自杀开关”，可在发生严重毒性时快速清除工程化细胞。虽然这与CAR T疗效无直接关联，但随着CAR疗法的普及，此类设计改进将成为应对罕见不良事件（如CAR诱导的T细胞淋巴瘤）的必需要求。预防性安全也可以通过抑制炎症级联放大来实现。机制研究已将单核细胞源性细胞因子（包括IL-1和IL-6）确定为细胞因子释放综合征(CRS)/免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)级联反应的关键驱动因子；因此，减少髓系活化的策略（例如限制GM-CSF信号）可以在不必然损害肿瘤杀伤的情况下降低毒性，尽管这种平衡依赖于具体情境。
检查点和细胞因子抗性是该领域最常进行风险权衡之处。PD-1或转化生长因子-β(TGF-β)通路 disruption 可增强CAR T在抑制性肿瘤中的功能，但这两条通路也抑制免疫病理反应。它们的广泛抑制（例如，使用单克隆抗体阻断PD-1）可能增加组织损伤、加速终末分化，或在自身免疫病中促进不受控的炎症。更安全的设计模式是将条件性抵抗（例如，将抑制信号重路由为共刺激的转换受体，或激活依赖性表达的显性失活受体）与可滴定活化和自杀开关相结合。
3 表观遗传重编程：重写耗竭程序与稳定期望的细胞命运
耗竭是由慢性刺激诱导的转录和染色质状态，其特征是增殖能力降低、效应功能改变和可重编程性受限。这有助于解释为何检查点阻断可以暂时改善功能，但常常无法持久地重置耗竭程序：它调节了信号传导，但未完全重写潜在的表观遗传景观。对于CAR T疗法，工程学问题在于如何在维持功能细胞可再生库的同时，在正确的时间和地点实现足够的效应分化。
直接转录因子工程可以改变这种平衡。过表达c-Jun可对抗耗竭相关的AP-1失衡，并在临床前模型中增强持久性和抗肿瘤活性。敲除耗竭相关转录因子（如NR4A家族）同样可改善CAR T在实体瘤中的功能。其他一些转录因子和信号通路（如CREM、CaMK4、Sirtuins、PPP2R2D）也被认为可改变CAR T细胞特性和耗竭。这些是改进CAR疗法前景广阔的途径，但也伴随着可预见的风险。耗竭阻断可能导致不受控的活化，伴随本底信号、细胞因子分泌增加或不受控的增殖。在癌症中，部分风险或许可与安全开关共存。但在自身免疫病中，相同的编辑可能加剧组织损伤，或将耐受性意图转化为炎症性疾病。
制造阶段的编程常被忽视为“过程”，但这却是最可靠的表观遗传杠杆之一。体外培养条件会印刻下长寿命的染色质可及性和分化轨迹。在扩增期间抑制PI3K/AKT通路可保留较少分化的记忆样表型，并在回输后改善抗肿瘤活性。mTOR通路也是一个可药物干预的途径，可深刻改变T细胞功能，提升其适应性、增殖和功能。在临床上，这意味着有时无需额外的基因组编辑即可实现“下一代”功能，这对可制造性和安全性至关重要。对于自身免疫应用，制造选择甚至更为关键：维持初始/记忆特征可能以更低的剂量支持持久的免疫重置；而对于CAR-Tregs，目标是稳定的抑制性身份，并避免向效应表型转化。
表观遗传重编程也通过患者中的偶然经验得以体现。临床观察已将TET2等表观遗传调节因子的 disruption 与CAR T扩增和持久性的改变联系起来，强调了染色质修饰因子如何重写细胞命运。其启示并非应常规破坏TET2，而是表观遗传状态是一个可主导结果的因果变量。未来策略可能转向靶向表观基因组编辑（将CRISPR–dCas9与染色质修饰因子融合），以沉默耗竭相关增强子或强化耐受性位点，而无需引入DNA断裂。这在概念上对自身免疫病颇具吸引力，但在实施前，递送和脱靶表观遗传效应仍是需要解决的主要障碍。
4 代谢重编程：使细胞适应其必须生存的组织环境
代谢应激是CAR T在实体瘤中失败的主要原因，也可能在发炎的自身免疫组织中影响其功能改变。肿瘤造成缺氧、活性氧、酸性和营养匮乏的环境，同时积累腺苷、乳酸等免疫抑制代谢物；这些条件直接损害T细胞增殖和效应功能。一个核心问题是，CAR T细胞通常在营养丰富、富氧的条件下被选择和扩增，这使它们为错误的环境做好了准备。因此，代谢编程必须在生理应激下进行评估，否则将无法转化。
共刺激生物学与代谢密不可分。CD28与4-1BB信号传导驱动不同的代谢程序，影响持久性、细胞因子输出和耗竭敏感性。除此之外，线粒体适应性已成为一个关键杠杆，因为它整合了能量生产、氧化还原信号和细胞凋亡敏感性。线粒体动力学（融合-分裂平衡）调节效应与记忆样表型并影响迁移；它还强调了肿瘤微环境内的细胞间线粒体转移是一种未被充分认识的机制，可能耗尽T细胞的生物能量，或在治疗性引导下恢复功能。这很重要，因为它将“肿瘤微环境抑制”部分重新定义为一种生物能量争夺战，而不仅仅是细胞因子信号传导。
选择性补充燃料是代谢工程在提升疗效和克服免疫抑制方面的一个具体例证。细胞外腺苷不应仅被视为一种通用的抑制性代谢物，而应被视为限制过度炎症的生理性组织保护通路的一部分。基础研究首先确立了腺苷受体信号是抑制炎症性组织损伤的内源性刹车，随后表明缺氧肿瘤可利用A2A受体通路来抑制浸润的抗肿瘤T细胞。在CAR T背景下，当CRISPR/Cas9介导的A2AR敲除被证明可增强CAR T效应功能和体内疗效时，该轴后来成为了直接的工程靶点。
Hu及其同事设计了过表达CD26和胞质腺苷脱氨酶1(ADA1)的CAR T细胞，将免疫抑制性腺苷转化为肌苷，后者是葡萄糖匮乏时的一种替代碳源。将ADA1与抗CD3单链可变片段融合旨在将酶活性定位于T细胞并减少对肿瘤的“燃料”供应；工程化细胞在小鼠实体瘤模型中显示出改善的迁移能力和对TGF-β介导的抑制的抵抗。其战略洞察在于，当代谢干预能同时清除抑制性代谢物（腺苷）并提供可用底物（肌苷）时，它们可兼作微环境干预。另外几个关键代谢酶（如PFKP、PP2A、谷氨酰胺酶1/2等）已被证明可深刻影响T细胞功能，值得考虑。或者，为CAR T细胞提供对抗活性氧(ROS)的解毒装备可能增强其稳定性。
代谢工程并非自动安全。肌苷并非私有资源；一些肿瘤细胞也能利用它。将ADA1定位于T细胞可降低但可能无法完全消除喂养肿瘤或改变旁观者免疫细胞的风险，尤其是在细胞间接触紧密的组织中。更广泛地说，禁用腺苷感知（例如A2A受体敲除）可能增加炎症损伤，因为腺苷也抑制过度的免疫活化。因此，代谢编辑应与安全开关或可滴定回路配对，并针对其在自身免疫病中的组织特异性风险进行评估。有趣的是，这些外源性代谢改善也可能用于改善T细胞衔接器疗法背景下的T细胞功能。
5 微环境重编程：将内在工程与生态位重塑相结合
即使经过良好编程的细胞，如果战场阻碍了其进入，也会失败。实体瘤存在物理性排斥（致密的细胞外基质、异常的脉管系统）、抑制性细胞因子（TGF-β、IL-10）、检查点配体（PD-L1）以及消耗营养并产生活性氧的抑制性髓系网络。忽视这些屏障的方法倾向于通过更高剂量和更强信号来补偿——这正是导致全身毒性的配方。
可以直接对运输和渗透进行工程化改造。酶促基质穿透（例如，表达乙酰肝素酶）可改善实体瘤模型中的浸润，但引入了脱靶风险，因为细胞外基质成分和基质靶点并非肿瘤独有。使趋化因子受体表达与肿瘤趋化因子梯度相匹配是一种补充策略，可以减少所需细胞数量；表达CCR2以跟随富含CCL2的肿瘤是一个典型例子。这些方法不仅应评估其是否增加了肿瘤浸润，还应评估其是否将生物分布转移到敏感的健康组织中。
局部免疫调节可以在不引起全身毒性的情况下重塑敌对的生态位，前提是真正实现局部化。分泌IL-12或IL-18等细胞因子的“装甲化”CAR T细胞可以募集内源性免疫，并将抑制性微环境转化为炎性环境。其安全陷阱是渗漏：组成性细胞因子分泌可重现CRS样综合征。合理的方向是诱导型、突触限制性或双抗原门控的载荷释放，而非组成性分泌，并辅以自杀开关作为备份。同样，外部联合疗法（放疗、溶瘤病毒、靶向髓系药物）的选择不应基于传统，而应基于机制匹配。线粒体代谢相关文献强调，某些联合治疗可能因施加损害CAR T细胞活力的氧化应激而失败，这意味着“生态位重塑”必须包括对CAR T生物能量的保护，而不仅仅是肿瘤增敏。
一个讨论较少的策略是在过继转移前重编程微环境，而不是强迫工程化细胞自身解决所有障碍。对缺氧-腺苷能轴的研究表明，补充供氧和抗缺氧策略可以削弱实体瘤中抑制T细胞效应功能的主要生化检查点。最近的研究报告，携氧全氟化碳纳米乳剂联合呼吸高氧可消除肿瘤缺氧，增加活化T细胞和NK细胞的瘤内浸润，并改善内源性或过继转移T细胞的疗效。由于这些数据尚不完全特定于CAR T，它们最好被视为过继性细胞疗法/CAR T的合理预处理策略，而非已确立的CAR T实践。然而，从概念上讲，它们与“失败模式驱动”框架高度相关：上游的肿瘤生物化学重塑可能减少对细胞产品本身内在过度工程化的需求。
自身免疫病提出了不同的微环境问题：慢性发炎的组织和淋巴结构可能维持致病性记忆。工程目标从“浸润肿瘤团块”转向“寻找并重置致病生态位”（生发中心、三级淋巴结构、靶器官），同时保护宿主防御。这有利于组织归巢编程、区域给药、可滴定活性和时限性持久。这也反对将癌症模式的组成性促炎装甲引入自身免疫病背景。对于CAR-Tregs，微环境编程部分涉及在发炎组织中的存活和稳定性；针对炎性细胞因子的抵抗工程必须与不受控抑制的风险相平衡。
6 讨论与展望
部分CAR疗法的失败源于产品与环境之间的不匹配。该领域最昂贵的错误是将疗效和安全性视为独立的优化问题。去除刹车、放大细胞因子或延长持久性的效力编辑，可能迅速将毒性从可控转变为灾难性，这在癌症和自身免疫病领域皆然。
在自身免疫病中，终点并非最大细胞毒性，而是在最小化不可逆免疫缺陷的前提下深度清除自身反应性B细胞亚群，这意味着靶向的抗原（CD19 vs BCMA）、组织分布、持久性和靶区室选择至少与原始效力同等重要。
以失败模式驱动的方法比技术驱动的迭代更为严谨。抗原逃逸指向多抗原识别和可重定向平台。运输失败指向趋化因子匹配、基质穿透和区域给药。代谢崩溃要求在生理应激下进行测试，并考虑肌苷补充或线粒体适应性控制等干预措施。毒性限制要求将可滴定回路和经过验证的安全开关作为标准组件，而非可选附件。
下一代的CAR疗法很可能是能够感知环境（缺氧、腺苷、炎性细胞因子）并计算反应（杀伤、抑制、扩增或关闭）的闭环系统。进展的衡量标准将不是编辑的数量，而是多层面重编程是否能在癌症和自身免疫病中带来可预测、可控风险的持久益处。
