可持续的抗菌及促进伤口愈合的水凝胶：负载克罗顿树（Croton confertus）提取物的细菌纤维素复合材料

《Materials Advances》：Sustainable antibacterial and wound-healing hydrogels: Croton confertus-loaded bacterial cellulose composites

　　开发可持续的、源自植物的抗菌聚合物生物材料对于管理与伤口环境相关的感染越来越重要，特别是在抗菌素耐药性日益增加的背景下。在本研究中，使用废弃物来源的果汁作为培养基，生产出了低成本的细菌纤维素（BC），随后通过与Croton confertus叶片提取物（CE）进行体外浸渍处理，制备出了具有生物活性的BC–CE复合材料。通过FE-SEM和FTIR分析表征了这些复合材料的物理化学结构，结果表明植物化学物质成功掺入了纳米纤维素基质中，显示出孔隙率降低、氢键结合增强以及微观结构稳定性提高。BC–CE薄膜比纯BC具有更好的保湿能力，在反复的膨胀/干燥循环中仍能保持结构稳定性。抗菌性能测试显示，这两种材料均形成了明显的抑菌圈（对金黄色葡萄球菌为1.28厘米，对大肠杆菌为1.11厘米），并且细菌增殖分别减少了46%和36%。体内伤口愈合实验进一步证明，与纯BC敷料相比，BC–CE处理的伤口上皮再生加快，炎症减轻。总体而言，这些发现突显了将植物来源的植物化学物质整合到可持续BC平台中的协同效益，提供了一种经济高效且生物相容性的聚合物生物材料，具有用于下一代具有抗菌功能的伤口护理应用的巨大潜力。

1. 引言

微生物感染是全球主要的健康问题，由于抗生素的滥用和管理不当，多重耐药性生物体的威胁日益严重。据报道，204个国家中有471万人死于抗菌素耐药性相关原因，其中114万人死于细菌感染。为了治疗微生物感染并克服几乎所有临床使用抗生素所出现的耐药性，人们付出了巨大努力来开发新型抗菌药物。除了创造新抗生素的时间消耗过程外，还需要创新的替代治疗方法来改变这一困境。植物提取物在这方面表现出显著效果，因为它们含有多种具有抗菌特性的生物活性化合物。植物提取物富含生物碱、黄酮类、萜类和酚类等次生代谢物。这些化合物不仅具有广谱抗菌活性，还能针对传统的细菌耐药机制发挥作用。

已经进行了大量研究，开发了富含植物提取物的抗菌薄膜，包括加入 cinnamon、guarana 和 rosemary 提取物的明胶和壳聚糖薄膜，10 加入柑橘提取物的明胶和甲基纤维素，11 加入 T. indica 的聚（乙烯醇）（PVA）和聚（乙烯吡咯烷酮）（PVP）薄膜，12 加入葡萄籽和 jabuticaba 果皮提取物的壳聚糖和明胶，13 加入 Gunnera tinctoria 和 Ugni molinae 提取物的果胶和淀粉薄膜，14 加入 Cryphaea heteromalla 水提取物的琼脂糖和 κ-卡拉胶薄膜，15 加入芦荟凝胶和大蒜皮提取物的明胶薄膜，16 以及加入石榴皮提取物的羧甲基纤维素和明胶薄膜。

在过去几十年中，细菌纤维素（BC）作为制造抗菌薄膜的理想聚合物平台受到了广泛关注。BC 由特定细菌菌株产生的外多糖组成，其化学结构与植物来源的纤维素相同，但缺乏木质素、果胶和半纤维素等伴随成分。因此，BC 具有极高的结晶度、出色的纯度、优良的液体保持能力、优异的生物相容性和较高的可塑性，优于植物纤维素。此外，BC 具有独特的三维（3D）网络结构，提供了更大的表面积、良好的柔韧性、高湿拉伸强度、优异的渗透性和弹性，使其成为掺入植物提取物的理想基底。BC 基质中含有大量功能基团，使得 BC 基质与植物提取物之间能够发生化学相互作用。BC 膜膜的高表面积和高孔隙率为 BC 与添加剂或植物活性化合物的物理相互作用提供了平台。许多研究记录了将植物提取物或活性植物分子添加到 BC 基质中，这不仅增强了 BC 的结构特性和生物相容性，还提供了抗氧化和抗菌等治疗效益。这些研究中包括添加印楝和鼠尾草，26Ageratum conyzoides L. 和 Chromolaena odorata L.，27Epilobium angustifolium，28H. rosa-sinensis，27Boswellia serrata，29Zingiber officinale 根和石榴皮。然而，还有大量具有药用价值的植物有待进一步研究，以开发用于治疗目的的 BC 复合物。Croton confertus（C. confertus）（大戟科）是一种生长在沙漠地区或干旱灌木丛中的树木，常见于埃塞俄比亚和阿拉伯半岛。尽管目前还没有关于 C. confertus 的科学报告，但其他 Croton 物种的研究已经揭示了它们的治疗效果。据报道，C. linearis 的叶片具有抗原虫活性，32 C. adipatus、C. thurifer 和 C. collinus 的精油具有抗菌活性。此外，先前还有研究报道了 C. urucurana Baillon 的抗菌活性，34 C. limae 的抗菌和调节作用，35 C. macrostachyus 的茎皮提取物的抗菌活性，36 C. nepetaefolius 的抗菌和抗生物膜活性，37 以及 C. cajucara 对人工生物膜和浮游微生物的抗菌活性。在 Croton 属中发现了多种化合物，包括乙酰阿勒里itol酸、β-谷甾醇、 campesterol、stigmasterol、sonderianin、catechin、gallocatechin germacrene D、E-香叶烯、β-香叶烯、limonene、1,8-cineole epi-longipinanol、甲基丁香酚、β-蒎烯、myricetrin 和 quercetin，这些化合物是其多种药理特性的来源。尽管 BC 具有出色的生物相容性、机械性能和显著的结晶度，但由于成本较高且缺乏治疗特性，其广泛应用仍然受到限制。因此，本研究旨在利用廉价且易获得的本地资源开发低成本的 BC 生产策略。通过结合 C. confertus 的乙醇提取物，将 BC 片材制备成了抗菌水凝胶。本研究的合理性在于所采用的体外方法的简便性，以及使用由廉价食品废弃物制成的可降解 BC 基质支撑。鉴于 Croton 属已有的良好药用潜力，BC–Croton confertus 复合材料有望传递植物提取物的治疗效果。由于 C. confertus 之前未被探索过其治疗应用，本研究首次对其进行了基于 BC 复合物开发的探索，这使其区别于以往基于其他植物提取物的 BC 复合材料报告。随后对这些复合材料的液体保持能力、再水化行为、抗菌活性和愈合潜力进行了评估。

2. 材料与方法

2.1 材料

C. confertus 叶片从阿曼的 Dhofar 地区采集。新鲜椰子水从当地市场购买并用作主要培养基。收集的椰子水在使用前经过彻底过滤和灭菌，以确保提供干净、营养丰富的细菌纤维素生产基底。此外，调整了果汁的pH值至5，并在70°C下进行灭菌。氢氧化钠（≥97.0%，颗粒状，NaOH）、琥珀酸（≥99.0%，C4H6O4）、d-(+)-葡萄糖（≥99.5%，C6H12O6）、乙酸（冰醋酸 ≥99.7%，CH3CO2H）、蛋白胨和琼脂（(C12H18O9)n 从Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，按原样使用，无需进一步纯化。

2.2 微生物培养

使用 MacConkey 培养基（MA）培养产 BC 的 Gluconacetobacter hansenii（G. hansenii）细菌。选择了两种代表性的菌株——大肠杆菌（E. coli，革兰氏阴性）和金黄色葡萄球菌（S. aureus，革兰氏阳性），以评估基于 BC-植物的复合材料的抗菌活性。使用 Luria Bertani（LB）肉汤在37°C和200 rpm下摇荡培养24小时。

2.3 BC 的生产、收获和纯化

将冷冻的 G. hansenii 接种到合成培养基中，在30°C和200 rpm下培养过夜，制备预培养液。将5%的预培养液加入剩余的水果和果汁制备的培养基中，在有氧条件下在30°C下培养一周。BC 片材出现在空气和液体培养基的交界面。收集片材后进行清洁和高压灭菌，以去除任何残留的细胞。片材储存在4°C下。

2.4 Croton confertus 植物化学物质的 Soxhlet 提取

植物叶片在室温下干燥约14天后研磨成细粉。使用乙醇和 Soxhlet 提取器提取5小时。多余的乙醇通过旋转蒸发器去除，得到深绿色的提取物。干燥后的提取物储存在4°C待进一步使用。

2.5 BC–生物提取物复合薄膜的制备

使用体外复合合成策略制备了含有 Croton confertus 叶片提取物（CE）的 BC 复合物。将 BC 片材浸入含有 CE（20% w/v）水溶液的烧杯中，并在搅拌下保持24小时，以确保提取物在 BC 基质中的均匀扩散。用于 BC 浸渍的提取物浓度（20% w/v）是根据我们之前的研究选择的，该浓度能够有效掺入植物来源的生物活性化合物并在 BC 基质中均匀分布。这种制备的 BC 复合物称为 BC–CE。

2.6 BC/植物提取物复合材料的表征

使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，Hitachi S-4800 和 EDX-350，Horiba，日本东京）确定 BC–CE 的形态特征。使用 PerkinElmer FTIR 光谱仪（Spectrum GX & Autoimage，美国）记录红外光谱（FTIR）。使用配备 Cu Kα 射线的 X 射线衍射仪（λ = 1.5406 ?）在 40 kV 和 30 mA 下记录衍射图谱。样品在 2θ 范围内以 2° min?1 的扫描速率扫描 10°–70°。

2.7 复合材料的吸水能力

通过计算其持水能力来确定 BC 和 BC–CE 的吸水能力。对于水保持时间（WRT）和持水能力（WHC）分析，将预切割的（4 cm × 3 cm）BC 和 BC–CE 样品在室温下置于水中直至重新湿润。为了计算 WRT，需要达到稳定的湿润状态。在不同时间间隔称量 BC 样品，直到它们达到稳定重量或完全干燥状态。对于 WHC，将样品放置在干燥室中完全去除水分，使用以下公式：

2.8 抗菌活性

根据圆盘扩散试验和平板计数技术确定 BC 和 BC–CE 对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）菌株的抗菌活性。

2.8.1 圆盘扩散试验

将 BC 和 BC–CE 片材切成圆形圆盘（6 mm），暴露于紫外线照射下2小时进行灭菌。然后将这些圆盘放置在预先培养了 S. aureus 和 E. coli 的 LB 平板上。作为阴性对照，使用纯 BC 圆盘，而青霉素圆盘（10 mg）作为阳性对照。培养后的平板在37°C下培养过夜。通过测量圆盘周围的抑菌圈来确定抗菌活性。

2.8.2 光学密度法

使用光学密度法评估 BC 和 BC–CE 薄膜的抗菌活性。将灭菌后的样品片（0.03 g mL?1）与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养物在37°C和150 rpm下培养15小时。通过使用 UV-vis 光谱仪在600 nm 处测量浊度来监测生长情况，空白培养基作为对照。

2.9 小鼠模型上的体内伤口愈合

从巴基斯坦伊斯兰堡的国家卫生研究院（NIH）获取2-3周大的雄性 BALB/c 小鼠（25–30克）。所有动物实验均获得了机构审查委员会（IRB）的批准，并遵循《实验室动物护理和使用指南》（美国国家研究委员会，2011年）。将十只小鼠随机分为两组（每组5只）：一组用 BC 处理，另一组用 BC–CE 处理。动物在无病原体条件下饲养，并可自由获取标准饲料。为了制造伤口，通过腹腔注射ketamine（80 mg kg?1）和 xylazine（10 mg kg?1）对小鼠进行麻醉。然后剃除背部毛发并用70%乙醇清洁。使用活检针切割出直径8毫米的全层组织，去除表皮和真皮层。切割后，使用紫外线消毒统一尺寸的 BC 支架，用生理盐水清洗，然后将样品直接应用于相应组的伤口上。在实验过程中，我们使用了单次应用BC（细菌纤维素）和BC–CE（细菌纤维素-天然植物提取物）作为一种非侵入性方法，以避免干扰早期细胞迁移和重新上皮化过程。在第0天和第7天观察伤口，以了解伤口愈合的程度。

2.10 统计分析

所有实验均重复进行了三次（n = 3），结果以平均值±标准差的形式呈现。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后通过Tukey的事后检验来评估各组之间的差异。p < 0.05的值被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论

3.1 成本效益高的BC生产和复合材料制备

图1提供了集成过程的示意图，从提取开始，然后是成本效益高的BC生产，最终将CE（天然植物提取物）浸入BC基质中，以获得生物活性的BC–CE复合材料。如图1A所示，CE首先是从Croton confertus中制备的，这是一种富含植物化学成分的药用植物，含有黄酮类、酚类和萜类物质，具有已证实的抗菌和伤口愈合潜力。41,42 植物材料经过洗涤、干燥、研磨和乙醇提取，得到适合后续使用的浓缩生物活性溶液。在CE制备之后，图1B展示了使用椰子水（阿曼南部丰富的农业资源）作为低成本发酵基质的BC形成过程。43,44 过滤和灭菌后，椰子水在静态条件下作为唯一的培养基，在7-10天内产生厚厚的BC膜。这种策略有效地替代了传统的葡萄糖和酵母提取物基培养基，从而降低了生产成本，同时促进了废物的转化和环境的可持续性。所得BC片材呈现出均匀且透明的外观，代表了一个具有均匀纳米纤维结构的纯纤维素网络。

图1示意性地展示了BC–CE复合薄膜的形成过程，包括植物提取物制备（A）、BC生产（B）和复合材料形成。在最后阶段，预先制备的BC薄膜通过外部浸泡法浸入之前提取的CE中。BC基质的内在孔隙性和亲水性促进了植物化学成分通过氢键和范德华力作用深入渗透和吸附。45,46 干燥后从米白色到深棕色的明显颜色转变提供了成功捕获的视觉确认。所得BC–CE复合材料保留了细菌纤维素基质的内在柔韧性和结构完整性，这使得在制备和潜在的伤口敷料应用中便于处理。总体而言，使用了两种本地可获得的材料——椰子水和Croton confertus，它们是生产多功能生物材料的可持续和经济可行的来源。这种策略消除了化学添加剂的使用，减少了废物，并使当地自然资源转化为增值的生物医学产品。预计BC–CE复合材料结合了BC的机械强度和亲水性以及天然植物提取物的抗菌和抗氧化特性。

3.2 BC、CE和BC–CE复合材料的FTIR和XRD分析

通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱研究了BC/CE复合膜的微观结构和分子相互作用。FTIR研究有助于理解功能基团的组成、氢键相互作用以及BC的聚羟基部分与CE的生物活性植物成分之间可能建立的化学链接，这些共同决定了复合材料的物理-化学和生物学行为。在原始BC的FTIR光谱中观察到了纤维素纤维的特征吸收峰：一个在3340–3360 cm?1的宽带，这是由于分子间O–H基团的拉伸振动，证实了存在广泛的氢键网络（纤维素纤维）；以及一个在约2890 cm?1的峰，与烷基C–H振动键相关。此外，1640至1650 cm?1范围内的带状信号是由于吸附的水的弯曲振动。47,48 同样，1050–1150 cm?1处清晰分辨的峰来自β-(1 → 4)-糖苷键的C–O–C拉伸，表明纤维素主链没有受到显著扰动。49 CE的光谱显示出在3300–3400 cm?1附近的强吸收（酚类化合物的O–H拉伸）、2920 cm?1（烷基团的C–H拉伸），以及在1720–1730 cm?1的显著峰，对应于酯类、黄酮类和萜类的CO拉伸振动。1500至1600 cm?1之间的额外带状信号表明存在芳香族的CC拉伸，而1020–1080 cm?1的信号对应于醇类和醚类的C–O拉伸。50–52 这些特征峰验证了多酚类、黄酮类和萜类成分的存在（CE的重要活性成分），它们作为具有抗氧化和抗菌特性的生物活性组分。BC–CE复合材料的FTIR光谱显示O–H拉伸带从3340 cm?1明显变宽并向大约3320 cm?1轻微移动，表明BC的羟基与CE的酚类化合物之间的氢键相互作用增强了。在纯CE中观察到的1725 cm?1的CO拉伸带在BC–CE中强度减弱，表明CE的羰基与BC的羟基之间可能发生了分子间相互作用。此外，1050–1150 cm?1区域的C–O–C和C–O带更加明显，这表明形成了新的氢键网络，从而CE成分在BC基质中均匀分布。

图2展示了BC、CE和BC–CE复合材料的FT-IR光谱（a）和XRD光谱（b）。这些光谱变化共同代表了BC和CE之间的物理吸附和化学相互作用，而不破坏纤维素结构。这样的相互作用预计将改善BC–CE薄膜的抗菌、抗氧化和疏水性，使其适合用于未来的生物医学应用，如伤口敷料或无菌包装材料。26,54

BC和BC–CE的XRD图谱如图2b所示。如图所示，纯BC在2θ ≈ 14–15°、16–17°和22–23°处显示出峰，对应于纤维素I的晶体平面。这些峰通常归因于（1?10）、（110）和（200）晶体学平面，证实了细菌纤维素纳米纤维的高度有序结构。在BC基质中加入Croton confertus植物提取物后，复合水凝胶保持了与纤维素I相关的主要衍射峰，表明细菌纤维素的核心晶体结构得到保留。与原始BC相比，复合样品的峰强度略低且带宽增加。这表明由于植物化学成分与纤维素纤维的氢键网络相互作用，结晶度有所降低。植物提取物在BC纳米纤维网络中的分子可能破坏了分子间的氢键，导致形式变得更加无定形，同时保持了纤维素的晶体框架。重要的是，没有观察到属于植物提取物不同晶体相的进一步晶体峰，表明提取物在BC基质中扩散良好，可能是无定形或分子分散的。XRD结果表明，Croton confertus提取物没有显著改变细菌纤维素的固有晶体结构，但峰强度的适度变化表明提取物与BC网络有良好的相互作用。这证实了水凝胶系统的结构完整性，并补充了SEM和FTIR数据。

3.3 制备的BC复合材料的形态和吸收能力

图3A展示了原始BC和BC–CE复合材料的SEM图像。纯BC显示出一个定义明确的3D纳米纤维网络，具有高度多孔和均匀的结构。55,56 随机分布的纳米纤维交织在一起，形成了类似于Acetobacter物种在静态培养下合成的纤维素的相互连接的孔隙网络。25,57 这种均匀的纤维几何结构有助于出色的保水能力、渗透性和机械柔韧性，使BC成为生物医学和组织工程应用的潜在材料。58,59 观察到连续且均匀的孔径分布，这可能对应于纤维素微纤维在生物合成过程中形成的氢键和结晶结构。在引入CE后，复合样品表现出显著的形态变化（见图3A下方面板）。纳米纤维变得更厚更密集，一些因植物提取物成分在BC网络内部和表面的沉积而聚集。表面也显示出较低的孔隙率和封闭的孔隙。这种较小的孔径可能是由于提取物中的酚类和萜类化合物通过氢键和π–π堆叠作用吸附在纤维素羟基上。46,60 这些相互作用导致BC的 compacted（压实的），这与宏观观察到的复合薄膜的深色和密度增加一致。生物提取物分子在纳米纤维素基质中的存在不仅提高了抗菌/抗氧化性能，还增强了二次界面交联。24,61

图3展示了BC和BC–CE复合材料的FESEM图像和孔径分布。（a）和（b）BC–CE的表面形态（a-i, b-i）和纯BC（a-ii）和（b-ii），显示复合材料的纤维堆积更紧密，孔隙率降低。（c-i）和（c-ii）孔径分布直方图表明BC–CE的孔径更小且更封闭。在CE添加后，复合材料的形态发生了明显变化（见图3A下方面板）。纳米纤维似乎变得更厚更密集，并且由于植物提取物成分的沉积而在BC网络内部和表面聚集。表面也显示出较低的孔隙率和闭合的孔隙。这种孔径的减小可以归因于提取物中的酚类和萜类化合物通过氢键和π–π堆叠作用吸附在纤维素羟基上。46,60 这些相互作用导致BC的致密化，这与复合膜宏观观察到的深色和更高密度一致。生物提取物分子在纳米纤维素基质中的存在不仅提高了抗菌/抗氧化性能，还通过形成二次界面交联增强了结构完整性。24,61

从图像分析得出的定量孔径分布（见图3（B）与形态学发现一致。在原始BC样品中观察到较宽的孔径分布（0.05–0.25 μm），最大频率峰集中在0.10 μm，表明了一个开放的细胞孔隙网络。相比之下，BC–CE复合材料建立了更窄的孔径分布，大多数孔径集中在0.05 μm以下（见图3）。向更小孔径的转变和新的“封闭细胞”峰（用红色突出显示）表明提取物分子部分填充了孔隙，并且一些孔隙被提取物分子封闭。这种行为与之前报道的加载了生物活性剂的低孔隙率BC基复合材料的结果一致，包括植物多酚、精油或纳米颗粒。62,63

总体微观结构的发展表明，CE与BC纳米纤维强烈相互作用，导致了一个密度更高、孔隙更少的基质。在加入Croton confertus提取物后观察到的孔径减小可能反映了细菌纤维素网络中纳米级孔隙的部分填充，而不是完全封闭。SEM观察确认了BC的三维纳米纤维结构得以保持，提取物沿纤维基质分布。这种结构配置可能有助于增强复合材料中植物化学成分的保留，同时保持细菌纤维素的固有孔隙结构。重要的是，细菌纤维素膜因其高孔隙率、优异的保水性和良好的氧气渗透性而广受认可，这些特性使它们非常适合用于伤口敷料应用。BC的互连纳米纤维网络通常为气体扩散和水蒸气传输提供了连续路径，这对于维持支持组织再生和伤口愈合的需氧环境至关重要。因此，尽管在添加提取物后纳米级孔径尺寸可能会减小，但复合结构预计仍能保持足够的透气性，以便氧气的交换，同时使生物活性植物化合物在BC网络中局部可用。这种微结构紧凑性可能有利于生物医学应用，其中需要适度的透气性和生物活性分子的保留。64,65

3.4 液体吸收和保持行为

研究了纯BC和BC–CE薄膜的动态水分吸收和释放行为，以评估它们作为调节湿度的生物材料的潜力。有效的湿气管理对于生物医学应用（如伤口敷料）尤为重要，因为在湿润且不导致组织坏死的条件下，可以加速组织修复并防止细胞因脱水而受损。图4(A)显示了两种样品较高的初始含水量，且在测试过程中由于自然蒸发作用，这种含水量逐渐减少。未经处理的木质纤维素（BC）的水分含量急剧下降，在50小时后几乎完全蒸发。相比之下，BC-CE复合材料在60小时的监测时间内表现出显著更高的残留水分含量。这种增强的保湿性能可能与Croton中积累的植物成分有关，这些成分包含多酚类化合物、萜烯和亲水性多糖。这些成分融入到BC纳米纤维结构中，促进了与水分子的氢键作用。这种分子相互作用不仅增加了亲水位点的密度，还形成了曲折的扩散路径，从而延缓了水分的蒸发，进而提高了长期的湿度稳定性。

图4显示了BC和BC-CE薄膜在60小时内的水分保持行为（A部分），以及BC和BC-CE在五个连续的吸水-干燥循环中的水分-含水量（WHC）（B部分）。数据以平均值±标准差（n=3）的形式呈现。统计显著性是通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后跟Tukey的事后检验（p<0.05）来确定的。两种材料的吸水能力也通过5个连续的肿胀-干燥循环进行了评估（图4(B)）。正如预期的那样，由于孔隙塌陷或微结构疲劳以及反复脱水现象导致纤维柔性的逐渐丧失，BC和BC-CE的WHC都随着循环次数的增加而逐渐下降。尽管如此，在整个循环过程中，BC-CE的WHC始终高于原始BC，并且证明了其在重新水化时更稳定。这一特性表明CE成分起到了增强和交联的作用，稳定了纤维素微纤维，并似乎减少了孔隙的过度压缩，有助于在反复的肿胀-干燥循环中保持BC网络的结构完整性。BC-CE中WHC的保持也可能与提取物分子和纤维素羟基团之间的界面相互作用有关，这进一步促进了干燥过程中BC基质的微观结构重组。这些观察结果与其他基于植物的添加剂的研究一致，包括芦荟、尼姆草和鼠尾草，其中发现生物活性成分可以提高水凝胶的弹性并减少重复吸水时的结构塌陷。此外，Croton代谢物的抗氧化和抗菌性质可能有助于通过防止氧化损伤和微生物降解来维持纤维素的结构。

综上所述，结果表明Croton的改性增强了BC基质的短期水分保持能力和长期的结构稳定性。BC-CE水凝胶具有控制的水分平衡维持能力、尺寸稳定性和机械刚性，这些都是生物材料敷料和环境响应型水凝胶应用的优异属性。BC/CE生物复合材料的潜力在于其独特的三维纳米纤维架构和CE的多功能性质，从而提供了一种具有改进的水稳性和治疗效益的可持续选择的天然功能化生物复合材料。

3.5. 植物提取物改性BC薄膜的抗菌评估、抑菌和杀菌活性

植物化学研究揭示了药用植物是生物活性化合物（如生物碱、黄酮类、单宁、萜烯和酚类）的丰富来源，这些化合物被认为具有协同的抗菌活性。这些植物化学物质干扰细菌的细胞膜、关键酶和群体感应及外排系统。通过圆盘扩散分析（DDA）和光密度（OD600）生长抑制试验，评估了所制备的BC-CE薄膜对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抗菌活性（图5A和B）。在DDA（图5A）中，BC-CE复合材料显示出对S. aureus的明显抑制圈为1.28厘米，对E. coli的抑制圈为1.11厘米，而纯BC则没有显示出抑制作用，证明它不具备杀菌性。阳性对照品氨苄西林对S. aureus的抑制圈为3.85厘米，对E. coli的抑制圈为3.42厘米。与E. coli相比，S. aureus的更高敏感性可以归因于革兰氏阳性细菌更简单的细胞壁结构，这使得疏水性植物化学物质能够进入细菌内部。这些发现与之前关于Croton物种的研究一致，其中C. urucurana和C. menyharthii的甲醇提取物对相同的细菌菌株表现出1.5–5 mg mL?1的最低抑制浓度（MIC）。与之前的报告相比，当植物提取物与BC结合时，BC-CE复合材料的活性略高。例如，在最近的一项研究中，使用败酱草（S. baicalensis）提取物制备的BC-SBAC复合材料对S. aureus显示出1.28厘米的抑制圈，对E. coli显示出1厘米的抑制圈。在之前的报告中，Aggeratum conyzoides L.的叶提取物（BC-AC）在圆盘扩散中对S. typhimurium显示出0.98厘米的抑制圈，对E. coli显示出0.84厘米的抑制圈；Chromolaena odorata L.的叶提取物（BC-CO）分别对S. typhimurium和E. coli显示出0.97厘米和0.68厘米的抑制圈。在这里，BC-CE复合材料对S. aureus显示出几乎相同的1.28厘米抑制圈，对E. coli显示出更高的1.11厘米抑制圈。

(a) 原始BC圆盘，(b) 氨苄西林药物和(c) BC-CE复合材料对S. aureus（A）和E. coli（B）的抗菌活性是通过圆盘扩散试验和OD600处的光密度测量来评估的（C）。数据以平均值±标准差（n=3）的形式呈现。统计显著性是通过单因素方差分析后跟Tukey的事后检验（p<0.05）来确定的。为了进一步了解这些观察结果，通过15小时培养期内的OD600测量来测量细菌生长抑制（图5B）。未经处理的纯BC样品显示出正常的细菌生长曲线，S. aureus的最终吸光值达到1.32 ± 0.04 a.u.，E. coli的最终吸光值达到1.29 ± 0.04 a.u.。相比之下，用BC-CE薄膜处理的培养物的生长明显减少，S. aureus降至0.71 ± 0.04 a.u.，E. coli降至0.82 ± 0.04 a.u.，分别相对于对照组减少了约46%和36%的细菌增殖。延长的迟滞阶段和较低的最终OD值证实了BC-CE薄膜的抑菌效果，这可能与BC纳米纤维基质中保留的生物活性植物化学物质有关。总体而言，BC-CE复合材料的更强抗菌能力归因于生物活性植物化学物质在纤维素中均匀沉积后的联合作用，遵循控制释放和持续效力的机制。S. aureus对CE中的代谢物更为敏感，而E. coli由于外膜的存在而表现出中等程度的抗性。CE的添加极大地改善了BC的抗菌性能，表明其作为一种基于自然的环保抗菌生物材料，可用于伤口敷料、支架和活性包装。

3.6. 伤口愈合评估

图6显示了纯BC膜和BC-CE复合材料的体内伤口愈合效率。在0天（未经处理时），两组的伤口部位都表现出新鲜的上皮组织破坏和红斑（圈出区域）。在使用BC和BC-CE处理后立即进行包扎（处理后的第0天），这两种材料都很好地附在湿润的伤口床上，形成了一个柔软且可渗透的膜。值得注意的是，BC-CE薄膜具有更好的适应性，这得益于其密集但略微更柔韧的质地（如形态学分析中所述），使其能够准确地贴合伤口部位并增强水分保持能力。

BC（对照）和BC-CE复合材料的体内伤口愈合评估。图像展示了治疗前0天的伤口情况、立即应用相应敷料后的情况，以及治疗后的第7天情况。与BC对照组相比，BC-CE处理的伤口显示出明显的收缩和表皮再生改善。到第7天，两组的伤口收缩和表皮闭合情况有显著差异。用BC处理的伤口仍然有部分红斑和未完全闭合；然而，用BC-CE处理的伤口显示出病变大小显著减小，炎症水平降低，并有新的上皮组织形成的迹象（图6，下方面板）。BC-CE增强了的伤口愈合活性可以归因于植物提取物中存在的生物活性成分的协同效应，如黄酮类、酚类和萜烯类，这些成分以其潜在的抗菌、抗炎和抗氧化活性而闻名。这些化合物可能抑制了局部微生物的生长，减少了氧化应激，并促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的沉积。此外，BC的结构特征在这种愈合过程中也至关重要。它的高水分保持能力和气体渗透性维持了有利于组织再生的湿润环境。CE的添加进一步通过控制渗出物水平和增强局部氧气交换来促进伤口愈合。提取物中的酚类分子可能形成了氢键，导致了二次界面交联，增强了机械稳定性，并持续释放了植物化学物质。这种控制释放使得伤口表面的抗菌作用得以延长，有助于通过形成肉芽组织和上皮化加速愈合过程。对于加载了其他植物提取物的BC复合材料，如芦荟、积雪草和日本忍冬，也报告了类似的结果，其中植物化学物质的加入显著增强了伤口闭合并减少了炎症反应。因此，在BC-CE处理的伤口中观察到的愈合进展表明，通过绿色体外方法成功地对BC进行了生物功能化，产生了一种成本效益高且可持续的伤口护理材料。尽管BC基质由于其多孔纳米纤维结构预计会促进植物化学物质的扩散，但本研究没有调查定量释放动力学，这将在未来的工作中进行探索。

4. 结论

本研究提出了一种可持续的高性能抗菌复合材料，该方法是将Croton confertus叶提取物注入到低成本、源自废物的细菌纤维素复合材料中。这种体外掺入方法实现了植物化学物质的均匀加载，而不损害纤维素网络。FTIR和FE-SEM分析确认了强烈的界面相互作用和微结构密度化，从而提高了水分保持能力和水凝胶稳定性。BC-CE复合材料对革兰氏阳性和阴性菌株都表现出强烈的抗菌活性，这可能与CE衍生的生物活性代谢物包含在BC基质中有关。体内评估进一步显示，与纯BC相比，BC-CE复合材料具有更快的伤口收缩和更好的表皮再生能力，这突显了植物提取物和BC支架的协同治疗效果。总体而言，BC-CE作为一种环保的、可扩展的生物材料，适用于抗菌敷料和伤口愈合应用。该策略利用了当地可用的资源，降低了生产成本，并为开发功能性生物聚合物复合材料提供了 green 的途径。未来的工作可能集中在优化提取物加载量、理解释放机制以及进行更广泛的临床前验证，以支持临床转化。此外，使用容易获得的基底和简单的制造策略表明BC-CE复合材料在实际生物医学应用中具有有希望的可扩展性和转化潜力。

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

支持本研究发现的数据以图表和表格的形式包含在文章中。在本研究过程中没有生成或使用任何外部数据集或软件代码。

致谢

作者衷心感谢阿曼萨拉拉Dhofar大学 sciences and Innovation for Environmental Sustainability 教席提供的科学支持。KOS 感谢比利时根特大学提供的BOF奖学金的财政支持。