考古人类骨骼蛋白质组的组成变异

《Journal of Archaeological Science》：Composition variations in archaeological human bone proteomes

　　

骨骼古蛋白质组学领域的采样策略通常基于标本的可获得性。骨生物学知识可能有助于优化样本选择策略，减少珍贵（古人类）材料的不必要取样。研究人员对来自4种骨骼元素的10个骨骼样本部位的10具成年考古人类遗骸进行了分析，比较了通过软骨内成骨和膜内成骨形成的骨骼元素，以及3个骨骼部位的皮质-松质骨配对的蛋白质组组成与修饰。研究人员观察到两种成骨过程形成的骨骼差异极小，仅软骨相关蛋白在软骨内骨样本中特异性存在。与松质骨蛋白质组相比，皮质骨表现出更高的蛋白质浓度、更多的蛋白质组和肽段数量，以及更低的天冬酰胺脱酰胺率，表明皮质骨提供了更优的保存环境。在整个分析中，岩骨表现突出，在所有研究个体中均恢复了最大且最复杂的蛋白质组。岩骨通过软骨内成骨形成，且在生命过程中几乎不发生重塑。研究结果表明，岩骨是获取古代蛋白质序列信息的理想来源。

研究背景与意义

骨骼古蛋白质组学在人类和动物演化研究中具有重要应用价值，可通过特定氨基酸替换解析系统发育关系，也可用于分析宿主健康状态及病原体相关蛋白。然而，古人类化石记录有限，需尽量减少破坏性取样。目前，古蛋白质组学采样多依赖标本可获得性，缺乏基于骨生物学的优化策略，而其他领域如古DNA和同位素分析已建立了成熟的采样规范。此外，活体骨骼存在两种成骨模式——软骨内成骨（endochondral ossification）和膜内成骨（intramembranous ossification），且同一骨骼包含皮质骨（cortical bone）和松质骨（trabecular bone）两种结构，其细胞组成、代谢速率和理化性质存在显著差异，这些差异如何影响考古骨骼蛋白质组的组成与保存尚不明确。本研究旨在揭示骨生物学特征对考古蛋白质组的影响，为古蛋白质组学采样策略优化提供依据。

研究方法概述

研究人员分析了荷兰阿纳姆圣尤西比乌斯教堂墓地的10具中世纪至后中世纪成年人类遗骸（4女6男，年龄18-49岁），无骨骼病理迹象。采样覆盖肋骨、股骨（软骨内成骨）、顶骨（膜内成骨）及其皮质-松质骨配对，并额外采集岩骨（petrous bone）样本。蛋白质提取采用改良EDTA脱矿法，经还原烷基化、胰蛋白酶/赖氨酸酶消化后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽段分离与鉴定。数据分析使用MaxQuant软件匹配人类参考蛋白质组数据库，结合SPIN（Species by Proteome INvestigation）流程进行质量控制，并通过rDeamidation计算脱酰胺率，所有统计分析在R环境中完成。

研究结果

3.1 蛋白质浓度

研究人员发现，校正取样量后，皮质骨蛋白质浓度显著高于松质骨（配对t检验，p=0.004），但两种成骨模式的皮质骨间无显著差异。岩骨蛋白质浓度与顶骨皮质骨相当，低于股骨和肋骨皮质骨。性别和年龄对皮质-松质骨配对蛋白质浓度无显著影响。

3.2 蛋白质组规模与组成

松质骨蛋白质组规模（蛋白质组数量）和肽段计数均显著小于对应皮质骨（p<0.001）。皮质骨中存在仅在皮质骨鉴定的蛋白质，如基质金属蛋白酶-2（MMP2）、跨膜蛋白119（TMEM-119）等，参与成骨过程；松质骨中则存在软骨中间层蛋白2（CILP2）等特有蛋白。不同成骨模式的皮质骨中，岩骨蛋白质组和肽段数量显著高于其他部位（Kruskal-Wallis检验，p<0.001），且在层次聚类中与其他骨骼明显分离。蛋白质丰度分析显示，岩骨中玻连蛋白（VTNC）、α-2-HS-糖蛋白（FETUA）等丰度更高。软骨相关蛋白（如胶原蛋白X型COL10A1、聚集蛋白聚糖ACAN等）仅在软骨内成骨样本中检出，其中COL10A1在岩骨中肽段丰度最高，MATN1仅存在于岩骨。免疫相关蛋白共43种，其中29种在岩骨中肽段数量最多，6种仅见于岩骨。序列覆盖度（SPIN氨基酸位点计数）分析表明，皮质骨显著高于松质骨（Two-way ANOVA，F=38.48，p<0.001），岩骨序列覆盖度最高（Tukey's HSD，p<0.001）。

3.3 脱酰胺作用

天冬酰胺（N）脱酰胺率总体高于谷氨酰胺（Q）（Wilcoxon秩和检验，p<0.001）。松质骨天冬酰胺脱酰胺率显著高于皮质骨（p<0.001），与早期全新世样本结果一致；谷氨酰胺脱酰胺率在两种骨类型间无显著差异。软骨内成骨样本的谷氨酰胺脱酰胺率高于膜内成骨（p=0.02），天冬酰胺脱酰胺率无差异。性别和年龄对脱酰胺率无显著影响。在所有皮质骨共享肽段中，岩骨天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺率均显著高于其他部位（One-way ANOVA，p<0.001）。

讨论与结论

本研究首次系统揭示了活体骨生物学特征对考古人类骨骼蛋白质组的影响。软骨相关蛋白在成人软骨内骨中的残留表明，骨重塑未完全清除初始成骨的蛋白质组分。皮质骨因更高的矿物密度和更低的含水量，蛋白质组更大且降解更少，优于松质骨。岩骨因极低的骨重塑速率，保留了最完整的蛋白质组，包括初始成骨阶段的软骨特异性蛋白，是古蛋白质组系统发育研究的理想来源。但岩骨同时是古DNA和同位素分析的优选部位，且取样破坏性极强，研究人员建议对珍贵古人类标本采取保守采样策略，优先选择软骨内成骨的皮质骨，必要时结合松质骨以提高系统发育信息覆盖率。

研究结论部分指出，考古骨骼蛋白质组的异质性反映了活体骨骼的生物学特征。岩骨在近期考古样本中已表现出最优的蛋白质组保存，在更深的时间尺度上优势将更为显著。研究成果为古蛋白质组学采样策略提供了实证依据，平衡了科学价值与标本保护的需求，对演化研究和古病理学研究具有重要意义。论文发表于《Journal of Archaeological Science》。