《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling reprograms extracellular electron transfer of Shewanella oneidensis
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微生物燃料电池中Shewanella oneidensis MR-1的电子传递链协同调控机制研究。通过对比过表达c型细胞色素组件与cAMP-CRP全局调控的效果，发现共表达CymA、CctA和MtrCBA的菌株CC-Mtr使最大功率密度提升29.5%，但生长受抑制。而cAMP-CRP调控显著上调细胞色素合成相关基因及无氧碳代谢通路，在cyaC菌株中实现电流密度0.94A/m2（32.1%高于野生型），功率密度0.50W/m2（1.3倍于对照）。研究表明全局转录调控比模块化表达更有效，为优化微生物电子传递系统提供新策略。
周朗|徐晓珍|李彩怡|李振忠|刘强强|杜丽琴|魏玉妥|潘世友
中国广西大学生命科学技术学院广西微生物与酶工程技术研究中心，南宁，530004
摘要
有限的细胞外电子转移（EET）效率限制了Shewanella oneidensis MR-1的电催化性能。尽管型细胞色素（-Cyts）网络对EET至关重要，但其调控机制仍不完全清楚。本研究系统地比较了过表达-Cyts组分与cAMP受体蛋白（CRP）调节对微生物燃料电池（MFCs）中EET效率的影响。单独过表达-Cyts未能增强EET效果。相比之下，共表达CymA、CctA和MtrCBA（CC-Mtr菌株）将最大功率密度提高到0.29 W/m2，比MR-1高出29.5%。这表明有效的EET需要跨膜电子转移链的协同作用。然而，CC-Mtr菌株的生长受到抑制。相比之下，cAMP-CRP的全局调节显著上调了参与-Cyts生物合成、细胞色素成熟和厌氧碳代谢的基因。这种策略改善了电子转移链和细胞生长。在cyaC菌株中，细胞内cAMP水平比MR-1高2.8倍，MFC电流密度达到0.94 A/m2，比野生型高出32.1%，比CC-Mtr菌株高出11.7%。这些发现表明，通过上调完整的电子传输链和cAMP-CRP介导的全局调节可以有效地增强EET，为优化微生物电合成系统中的电子转移提供了有前景的策略。
引言
微生物电合成（MES）是一种利用可再生电力驱动微生物合成的新兴技术（Harnisch等人，2024年）。在这一领域中，电活性细菌Shewanella oneidensis MR-1是一个关键的模型生物，它表现出显著的双向细胞外电子转移（EET）能力（Mattanovich等人，2021年）。它可以将电子输出到细胞外受体（例如金属氧化物或电极），并利用来自供体的电子来驱动细胞内还原反应（Okamoto等人，2014年；Ross等人，2011年）。这种多功能性源于其多样的呼吸途径和大量的膜结合电子转移蛋白（Ford等人，2024年）。大多数增强EET的策略集中在调节一般的细胞代谢上，包括优化底物摄取（Pinchuk等人，2009年）、操纵NAD(H)池（Li等人，2018年）、表达型细胞色素（-Cyts）（Dundas等人，2020年）、组装纳米线（Subramanian等人，2018年）以及工程化生物膜的导电性（Chadwick等人，2019年）。尽管如此，微生物燃料电池（MFCs）的功率密度仍停留在102–103 mW/m2，远低于化学燃料电池。
MR-1中的EET是由一个保守的-Cyts网络促进的，该网络负责将电子穿过细胞膜（Kumar等人，2017年）。这一过程从内膜的CymA开始，CymA是一种四血红素-Cyts，它氧化甲萘醌并将电子转移到周质中。这些电子随后通过周质载体如CctA和FccA传递，然后通过MtrCAB复合体穿过外膜（Coursolle和Gralnick，2010年）。后者是一个模块化单元，由孔蛋白MtrB、周质十血红素细胞色素MtrA和外膜细胞色素MtrC组成。与OmcA一起，它们作为终端还原酶，直接还原细胞外底物，如不溶性金属氧化物（Coursolle和Gralnick，2010年；Ross等人，2011年）。
针对-Cyts网络的基因干预显示出显著提高EET效率的潜力（Chang等人，2014年）。外膜细胞色素的关键作用体现在ΔmtrC/ΔomcA突变体在缺氧条件下无法还原Fe(III)矿物（Mitchell等人，2012年）。相反，过生产关键的EET组分，如Mtr复合体和主要周质载体CctA，已被证明可以增加电子转移速率（Fu等人，2014年；Mitchell等人，2012年）。值得注意的是，CctA和FccA是最丰富的周质-Cyts之一，它们将电子从CymA传递到外膜还原酶（Alves等人，2015年）。调节它们的表达可以带来意想不到的收益；例如，破坏特定的周质细胞色素（NapB、FccA、TsdB）据报道可以将电流密度提高3.6倍，达到0.44 W/m2（Sun等人，2021年）。先前的研究表明，单独过表达细胞色素不太可能增强MR-1中的EET，因为EET依赖于高度协调的、空间组织和多组分的电子传输链（Kouzuma等人，2015年）。仅仅增加一个组分的数量并不能改善整体电子通量，甚至可能有害。然而，迄今为止的大多数研究都集中在单个组分上，效果有限。这表明需要一种系统级的策略来工程化-Cyts网络，以充分利用MR-1的EET能力。
新兴证据表明，环腺苷酸受体蛋白（cAMP–CRP）系统在MR-1中作为EET途径的关键全局调节器（Fu等人，2013年；Yin等人，2016年）。它通过激活还原多种电子受体（如Fe3?、富马酸和亚硝酸盐）的基因来协调厌氧呼吸（Kasai等人，2019年）。CRP以cAMP依赖的方式直接结合< />和omcA的启动子，从而增强金属还原和EET能力（Kasai等人，2015年）。该系统还响应环境信号，包括亚硝酸盐积累，这会耗尽cAMP并抑制CymA（Jin等人，2016年）。它们还涉及升高的cAMP，这会促进分解代谢状态同时抑制有氧呼吸（Yin等人，2016年）。总的来说，这些发现表明，增加cAMP–CRP活性可以通过上调-Cyts组分和优化呼吸途径来增强EET。然而，cAMP对电子通量的系统影响仍不完全清楚，关于调控冗余、补偿途径以及在非呼吸条件下释放的细胞色素的作用仍存在关键知识空白。
在这里，本研究探讨了通过cAMP-CRP系统进行的全局转录重编程如何增强MR-1中的双向EET，并将其效果与模块化细胞色素工程进行了对比。研究结果揭示了一种更优越、协调的调控机制，并为工程化电活性微生物以推进生物生产提供了通用策略。
部分摘录
培养条件和质粒构建
本研究中使用的菌株和质粒列在表1中。Shewanella oneidensis和Escherichia coli分别在30°C和37°C的LB培养基中 aerobic 条件下生长。质粒构建是在添加了卡那霉素（50 μg/mL）的E. coli DH5α中进行的。使用广宿主范围质粒pBBR1MCS-2作为骨架，通过Gibson组装将组成型启动子Plac替换为强启动子Ptac，生成质粒pZ1。携带
通过模块化细胞色素表达增强电子转移
为了增强跨膜电子转移，分别过表达了来自MR-1内膜的< />、周质的< />以及外膜的< />和omcA编码的-Cyts基因（图2a）。EET效率的影响因过表达的基因而异，反映了它们在电子传输途径中的不同功能作用。值得注意的是，只有过表达< />和< />的菌株产生了轻微的电压增加（约0.24 V），表明单一组分
讨论
尽管Shewanella基因组编码了许多-Cyts，但只有少数几种对电能转换的生理作用和贡献已经明确。在-Cyts网络中，电子通过CymA、CctA、MtrA、MtrB和MtrC等组分的血红素基团的氧化还原状态变化依次传递（Philipp等人，2025年）。这一过程严重依赖于维持这些蛋白质之间的精确化学计量平衡。单独过表达一个-Cyts（例如
结论
本研究表明，cAMP介导的全局转录调控在增强MR-1中的EET方面具有优越性能。在工程化的菌株中，CyaC菌株在发电和生物还原方面表现出卓越的能力。它实现了0.50 W/m2的最大功率密度，比对照组高出1.3倍，且高于模块化细胞色素共表达菌株CC-Mtr。CyaC菌株还表现出最高的Cr(VI)还原率，超过
CRediT作者贡献声明
李彩怡：研究、数据管理。李振忠：概念构思。刘强强：数据管理。杜丽琴：方法学。周朗：撰写——初稿、方法学、数据管理、概念构思。徐晓珍：软件、方法学。魏玉妥：项目管理、资金获取。潘世友：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢中国国家自然科学基金（项目编号52270121）和广西壮族自治区自然科学基金（项目编号2023JJD160010）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
