《Plant Stress》：Exploring quinoa’s plant growth-promoting bacteria: a Pseudomonas seed endophyte promotes salinity tolerance and modifies root architecture in Arabidopsis thaliana
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本文系统研究了从耐盐作物藜麦种子中分离出的可培养内生细菌，重点关注其促植物生长（PGP）特性和缓解盐胁迫的潜力。研究鉴定出一株具有多种PGP特性（如ACC脱氨酶活性、IAA、铁载体、有机酸、胞外多糖（EPS）产生以及磷、钾溶解和固氮能力）的假单胞菌（Pseudomonas putida A7）。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）模型中的验证实验表明，该菌株能够减轻盐胁迫（100 mM NaCl）对生物量和叶绿素含量的负面影响，并显著促进侧根形成。转录组分析揭示了A7可逆转由盐胁迫引起的多个功能类别基因（如AtCYCD2, AtANR1, AtNTR2.1, AtHEMA, AtGRX3/4, AtSOS1等）的下调，从而在细胞分裂、氮素转运感知、光合作用、氧化还原稳态和离子平衡等通路中发挥作用，增强植物的耐盐性。本研究为利用种子内生菌开发农业生物接种剂以应对盐渍化挑战提供了新见解。
引言
植物与有益微生物的共生关系对于其生长发育以及对生物和非生物胁迫（包括盐度）的适应性至关重要。在这些微生物中，植物促生细菌（PGPB）因其能够通过多种机制促进植物生长和缓解胁迫而备受关注。这些机制包括溶解磷（P）、钾（K），产生植物激素（如生长素）、有机酸、胞外多糖（EPS）、铁载体，具有ACC脱氨酶活性以及固氮能力。在盐胁迫条件下，PGPB分泌的EPS可以结合Na+并限制其被植物吸收，同时还能通过增强脯氨酸积累和抗氧化酶活性等保护机制来缓解盐分的负面影响。
种子内生菌是一类研究相对较少的植物相关微生物，它们源自母株，水平或垂直传播，被认为有益于种子萌发和幼苗建成，并可能早期激活宿主植物的生物和非生物胁迫耐受/抵抗机制。因此，幼苗/植物能自然“预适应”以应对胁迫条件，包括细菌自身能够抵抗的条件（例如耐盐PGPB）。
藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）是一种原产于南美洲安第斯地区的盐生作物，对高盐、霜冻和干旱等多种非生物胁迫因子表现出极强的耐受性，是研究植物相关有益微生物的绝佳材料。本研究旨在填补知识空白，鉴定并评估藜麦种子可培养内生细菌的PGP特性，并研究一株具有多种PGP特性的选定细菌菌株对盐敏感模式植物拟南芥在盐和非盐条件下的形态、生化和转录水平的影响。
材料与方法
从智利安第斯高原Colchane地区（南纬19°16‘34”，西经68°38‘16”，海拔3702米）的栽培田采集了藜麦品种Pandela的种子。通过氯气暴露对种子进行表面消毒，研磨后稀释涂布于LB和TSB固体培养基，分离得到15株可培养的内生细菌菌株。
对所有菌株进行了耐盐性（在含1%至32% NaCl的LB培养基上生长）以及多种PGP活性的筛选，包括：吲哚-3-乙酸（IAA）产生、铁载体产生、有机酸产生（OAP）、胞外多糖（EPS）产生、磷（P）和钾（K）溶解、ACC脱氨酶活性和固氮（Nfb）能力。通过MALDI-TOF质谱和16S rDNA测序对菌株进行鉴定。
基于PGP活性评估，选择得分最高的菌株A7（经16S rDNA鉴定为Pseudomonas putida）作为接种剂，在拟南芥中进行验证实验。将5天龄的拟南芥幼苗转移到添加或不添加100 mM NaCl的MS培养基上，并接种A7菌悬液。培养12天后，评估幼苗鲜重、根系结构（主根长度和侧根数量）、脯氨酸含量、光合色素含量，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）分析涉及细胞分裂、光合作用、硝酸盐转运、氮感知、离子稳态、脯氨酸代谢、氧化还原状态以及生长素转运和信号传导等功能类别的多个基因的表达水平。
结果
菌株形态、耐盐性及PGP特性
从表面消毒的藜麦种子中分离出的15株细菌均为耐盐菌，所有菌株都能耐受1%、2%和4%的NaCl，其中13株能在16% NaCl下生长，被归类为中度嗜盐菌；菌株A1、A6和A13能在32% NaCl下生长，为极端嗜盐菌。形态学和革兰氏染色显示，存在革兰氏阳性球菌和杆菌，以及革兰氏阴性杆菌或球杆菌。
PGP活性筛选显示，不同菌株具有不同的特性组合。其中，菌株A7（Pseudomonas sp.）表现出最广泛的PGP特性：具有磷酸盐和钾溶解能力、产生铁载体、有机酸、IAA，具有ACC脱氨酶活性和固氮能力，总分最高。菌株A3（Enterobacter cloacae）也表现出多种活性。值得注意的是，产生铁载体以及溶解P和K的菌株数量很少，而具有ACC脱氨酶活性的菌株比例较高。
分子鉴定（MALDI-TOF和16S rDNA）确认A7为Pseudomonas putida。在盐胁迫下，A7菌体内的脯氨酸含量显著增加。
菌株A7对拟南芥生长和根系构型的影响
在无盐条件下，单独接种A7会抑制拟南芥幼苗的鲜重和主根伸长。然而，在盐胁迫（100 mM NaCl）下，A7能将幼苗的鲜重和叶绿素含量恢复至对照（无盐无菌）水平。
盐分显著减少了侧根数量。相反，接种A7无论在非盐还是盐条件下，都显著增加了侧根的数量，尽管主根长度仍然受到抑制。这表明A7能够改变根系构型，促进根系分支。
菌株A7对生化反应的影响
盐胁迫导致拟南芥幼苗中脯氨酸含量增加约4倍。在无盐条件下，接种A7使脯氨酸水平比未接种对照增加约2倍；但在盐条件下，A7的存在并未显著改变盐胁迫诱导的脯氨酸积累。
盐分降低了叶绿素a和叶绿素b的含量。在盐培养基上，A7能将叶绿素a浓度恢复至对照水平，并提高叶绿素b含量（相对于单独盐处理）。总类胡萝卜素含量不受盐分或A7的影响。
基因表达对盐分和接种A7的响应
qRT-PCR分析揭示了盐分和A7接种对多个功能基因表达的调节：
- 1.
盐分调控的基因：许多基因在盐胁迫下表达下调，包括AtHEMA（叶绿素合成）、AtCYCD2（细胞周期）、AtNRT1.1（硝酸盐转运/生长素外排）、AtANR1（氮传感）、AtASA1（生长素合成）、AtGRX3/4（氧化还原）、AtNHX1和AtSOS1（离子稳态）、AtProDH1/2（脯氨酸分解）。只有AtHKT1（Na+转运）和AtP5CS（脯氨酸合成）在盐条件下上调。
- 2.
A7单独调控的基因：在无盐条件下，A7下调了AtCYCD2、AtHEMA、AtNRT1.1、AtHKT1、AtNHX1和AtSOS1的表达，但上调了AtANR1和AtASA1。
- 3.
A7在盐胁迫下的调控：与单独盐处理相比，A7上调了AtCYCD2、AtHEMA、AtNRT2.1、AtANR1、AtGRX3/4、AtSOS1和AtNHX1等基因的表达，通常将它们恢复至（或超过）对照水平，从而逆转了盐诱导的下调。
讨论
藜麦种子内生细菌多样性与适应性
本研究分离到的藜麦种子内生细菌以耐盐/嗜盐的葡萄球菌属（Staphylococcus）为主，特别是S. xylosus和S. aureus，这与其所处的安第斯高原盐渍土壤环境相适应。假单胞菌A7（P. putida）表现出最强的综合PGP潜力和耐盐性。菌株A7在盐胁迫下自身脯氨酸积累显著，这可能是其耐盐机制之一。有趣的是，具有ACC脱氨酶活性的菌株比例很高，这可能有助于在种子萌发和幼苗建立早期缓解盐胁迫诱导的乙烯积累，是一种生态适应策略。
菌株A7增强拟南芥耐盐性与根系改建的机制
在盐胁迫下，A7能缓解拟南芥生长的抑制并恢复叶绿素水平，表现出胁迫缓解能力。这种效应与其多种PGP特性相关：
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ACC脱氨酶：降低胁迫乙烯水平，减轻生长抑制。
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生长素（IAA）产生：与ACC脱氨酶协同作用，共同调控根系发育。A7产生的IAA可能促进侧根起始，而ACC脱氨酶活性则缓解乙烯对侧根伸长的抑制，从而导致侧根数量增加，改变根系构型以更好地应对胁迫和获取养分。
- •
营养活化：溶解磷、钾，产生铁载体和固氮能力，可能改善了盐胁迫下的营养状况。
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间接生理调控：可能通过调节植物内源激素平衡或产生其他活性物质发挥作用。
基因表达分析为A7的胁迫缓解作用提供了分子层面的解释：
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生长与发育：A7恢复了盐胁迫下调的细胞周期基因AtCYCD2和叶绿素合成基因AtHEMA的表达，与生物量和光合色素恢复的表型一致。
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氮素代谢与感知：A7上调了硝酸盐转运蛋白基因AtNRT2.1和氮传感转录因子基因AtANR1，可能改善了氮素利用，并与侧根发育调控有关。
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氧化还原稳态：A7逆转了盐胁迫对谷氧还蛋白基因AtGRX3/4的下调，可能增强了植物的抗氧化能力。
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离子稳态：盐胁迫下调了Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1和AtSOS1的表达，而A7（特别是对AtSOS1）能恢复其表达，表明A7可能帮助植物重建离子外排或区隔化能力，这是耐盐性的关键机制。
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渗透调节：A7处理在无盐条件下即诱导了脯氨酸合成基因AtP5CS的上调和降解基因AtProDH的下调，导致脯氨酸积累，这可能是一种“预适应”或“ priming”效应，使植物在面对后续盐胁迫时准备更充分。
值得注意的是，在无胁迫条件下，A7对拟南芥生长有轻微抑制作用，但在胁迫下表现出显著的缓解作用，这与许多生物刺激素或“ priming”处理的特点类似，即在最优条件下代价微小，而在胁迫条件下益处显著。
结论
本研究成功从藜麦种子中分离并鉴定了一系列具有耐盐性和多种PGP活性的可培养内生细菌。其中，Pseudomonas putida A7菌株展现出最全面的植物有益特性。在拟南芥模型中的实验证实，A7能够有效缓解盐胁迫对生长的抑制，保护光合机构，并通过影响生长素和乙烯通路显著改变根系构型（增加侧根）。这些有益效应与A7调控宿主多个关键生理和分子通路的能力相关，包括细胞周期、光合作用、氮素转运、氧化还原平衡和离子稳态等。
未来的研究可以比较不同耐盐性藜麦品种的种子微生物组差异，并进一步在土壤或田间条件下验证这些内生菌（单菌或 consortium）对提高盐敏感作物抗逆性的潜力。对种子全微生物组（包括不可培养菌、真菌等）的深入解析，将有助于更全面理解植物-微生物互作在胁迫适应中的作用，为开发基于微生物组的可持续农业策略提供新资源。
