《Oncogene》：Hypoxia-induced XBP1s-MYDGF axis suppresses ferroptosis through UBQLN1-mediated stabilization of LCN2 in gastric cancer
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缺氧肿瘤微环境是实体瘤进展和耐药的关键驱动因素，尤其对铁死亡（一种铁依赖的程序性细胞死亡）的调控机制尚不完全清楚。本研究聚焦胃癌，揭示了缺氧触发的XBP1s-MYDGF信号轴通过竞争性结合泛素衔接蛋白UBQLN1，抑制铁载体蛋白LCN2的降解，进而通过螯合活性铁、抑制脂质过氧化来抵抗铁死亡。该发现不仅阐明了胃癌细胞在缺氧下的新型生存机制，还为靶向XBP1s-MYDGF-UBQLN1-LCN2轴、克服缺氧相关铁死亡抵抗提供了潜在治疗策略，对推动晚期肿瘤治疗范式转变具有重要意义。
面对全球范围内发病率和死亡率均位居前列的癌症，科学家们不断探寻着其肆虐背后的秘密。胃癌，作为一种恶性程度高、预后不佳的消化道肿瘤，其进展与一种特殊的肿瘤微环境——缺氧——密不可分。想象一下，肿瘤细胞在体内疯狂增殖，抢夺有限的氧气资源，导致其核心区域长期处于“窒息”状态。这种缺氧环境非但没有消灭肿瘤，反而像一个“压力训练营”，迫使肿瘤细胞进化出强大的生存技巧，以抵抗包括化疗在内的多种治疗手段。其中，一种名为“铁死亡”的新型细胞死亡方式，近年来成为癌症治疗领域备受瞩目的“新星”，它依赖于铁离子和脂质过氧化来清除癌细胞。然而，狡猾的肿瘤细胞似乎也找到了对抗铁死亡的方法，尤其是在缺氧的庇护下。那么，胃癌细胞究竟如何利用缺氧微环境来“武装”自己，抵抗铁死亡的“追杀”呢？这其中的分子“兵工厂”和“防御工事”又是如何运作的？解答这些问题，对于攻克胃癌治疗耐药、开发新型疗法至关重要。近期，一项发表于顶级期刊《Oncogene》的研究，为我们揭开了这个谜团的关键一角。
为了深入探究上述科学问题，研究人员采用了一系列现代生物学的关键技术。他们首先整合了来自GEO数据库的两个关键胃癌及癌前病变的单细胞RNA测序数据集，通过生物信息学分析揭示了基因表达的细胞异质性。在功能验证层面，研究使用了多种人胃癌细胞系，并在体外构建了缺氧模型以模拟肿瘤微环境。通过基因敲低、过表达、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光染色等技术，研究人员在蛋白质水平验证了分子间的相互作用与调控关系。细胞死亡类型的鉴定依赖于特定的抑制剂，而铁死亡的关键指标——脂质活性氧和丙二醛水平，则分别通过流式细胞术和比色法进行检测。此外，染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因实验证实了转录因子对靶基因的直接调控。最终，研究结论通过小鼠皮下移植瘤模型在体内得到了验证。
MYDGF在胃癌细胞中高表达
通过对胃癌单细胞转录组数据的整合分析，研究人员将上皮细胞分为多个亚群。分析发现，与正常上皮细胞相比，恶性上皮细胞显著富集了HIF1信号通路、糖酵解等肿瘤相关通路。在恶性上皮细胞中特异性高表达的基因中，髓系来源生长因子展现出独特的表达模式。进一步分析显示，MYDGF高表达的恶性上皮细胞显著富集于内质网蛋白质加工、泛素化介导的蛋白水解等通路。在多个独立的胃癌组织转录组数据集中，MYDGF在肿瘤组织中的表达也显著高于癌旁正常组织。这些发现提示MYDGF在胃癌中可能扮演重要角色，并且其功能可能与蛋白质降解通路相关。
MYDGF抑制缺氧条件下的胃癌细胞铁死亡
研究人员首先验证了缺氧确实能够上调胃癌细胞中MYDGF的蛋白表达。在缺氧条件下，敲低MYDGF会进一步降低细胞活力，而过表达MYDGF则在一定程度上起到保护作用，表明MYDGF有助于胃癌细胞在缺氧环境下存活。通过使用铁死亡、凋亡和坏死性凋亡的特异性抑制剂，研究发现缺氧以及MYDGF敲低所促进的细胞死亡，能够被铁死亡抑制剂部分逆转。进一步的检测发现，缺氧显著增加了细胞内的脂质活性氧和丙二醛水平，而MYDGF敲低在缺氧条件下进一步加剧了这一现象，且该效应可被铁死亡抑制剂抵消。透射电镜观察也发现，缺氧条件下MYDGF敲低的细胞表现出典型的铁死亡线粒体形态改变，如线粒体缩小、膜密度增加。这些结果综合表明，MYDGF能够抑制缺氧诱导的胃癌细胞铁死亡。
MYDGF通过抑制LCN2的泛素化降解来抑制铁死亡
为了探究MYDGF抑制铁死亡的机制，研究人员通过蛋白互作数据库分析，发现铁死亡相关蛋白LCN2是MYDGF潜在的互作蛋白。实验证实，缺氧降低了LCN2的蛋白水平但不影响其mRNA水平，表明存在转录后调控。MYDGF敲低会降低LCN2蛋白，而过表达则增加其蛋白水平，同样不影响mRNA。功能上，过表达LCN2可以逆转MYDGF敲低导致的脂质过氧化和细胞内亚铁离子水平升高。机制上，缺氧通过蛋白酶体途径促进LCN2降解，并增加其泛素化水平。MYDGF能稳定LCN2，抑制其蛋白酶体降解，缩短其蛋白半衰期，但不影响其整体泛素化水平。在动物实验中，MYDGF过表达减弱了铁死亡诱导剂IKE对移植瘤的抑制作用，而敲低LCN2则增强了IKE的疗效，并且消除了MYDGF的保护作用。肿瘤组织内的丙二醛水平变化也与此一致，从而在体内验证了MYDGF-LCN2轴在抑制铁死亡中的作用。
MYDGF通过抑制内质网相关降解来稳定LCN2
前期研究表明MYDGF能稳定LCN2，抑制其泛素化-蛋白酶体降解。由于单细胞数据提示MYDGF高表达细胞富集内质网蛋白加工通路，且缺氧可引发内质网应激并激活内质网相关降解，研究人员推测LCN2的降解可能通过此途径。使用内质网相关降解抑制剂eeyarestatin I处理，可以阻断缺氧引起的LCN2降解。免疫荧光显示LCN2与内质网标志物存在共定位。更重要的是，eeyarestatin I处理完全阻断了MYDGF敲低或过表达对LCN2蛋白水平的调控作用。进一步研究发现，eeyarestatin I不改变MG132存在时LCN2的泛素化水平，但单独使用时会增加泛素化LCN2的积累，这表明其通过阻断泛素化蛋白从内质网向胞质的转运来发挥作用。这些结果证实，缺氧通过内质网相关降解途径降解LCN2，而MYDGF的稳定作用依赖于该通路。
UBQLN1依赖内质网相关降解途径降解LCN2
由于MYDGF敲低促进LCN2降解但不影响其泛素化，研究人员推测MYDGF可能通过影响E3泛素连接酶或泛素-蛋白酶体衔接蛋白起作用。数据库分析发现UBQLN1和UBQLN2是潜在的LCN2互作蛋白，且两者也能与MYDGF结合。实验证实，只有敲低UBQLN1能显著增加LCN2蛋白水平。UBQLN1敲低导致的LCN2积累，能被eeyarestatin I或MG132处理所阻断，表明UBQLN1介导的LCN2降解依赖于内质网相关降解和蛋白酶体活性。与UBQLN1作为衔接蛋白的功能一致，其敲低并不改变LCN2的泛素化水平。这些结果说明，UBQLN1特异性促进LCN2通过内质网相关降解-蛋白酶体途径降解，且不涉及其泛素化修饰的改变。
MYDGF通过竞争性结合UBQLN1抑制LCN2降解
研究表明，UBQLN1敲低后，MYDGF敲低或过表达对LCN2水平的调控作用均被消除，证明MYDGF的作用依赖于UBQLN1。免疫共沉淀和免疫荧光实验证实了内源性和外源性MYDGF与UBQLN1、以及LCN2与UBQLN1之间的相互作用及共定位。竞争性免疫共沉淀实验显示，MYDGF敲低增加了UBQLN1结合的LCN2量，而过表达MYDGF则减少了其结合量。这表明MYDGF通过竞争性结合UBQLN1，阻止了UBQLN1对LCN2的识别和后续的降解。
UBQLN1通过STI1-4和UBA结构域调控与MYDGF和LCN2的竞争性结合，并特异性识别LCN2上的K48连接泛素链
为了阐明竞争性结合的分子细节，研究人员构建了UBQLN1的一系列截断突变体。实验发现，MYDGF与UBQLN1的结合依赖于其STI1-4结构域，而LCN2与UBQLN1的结合则需要UBA结构域。在MYDGF敲低的背景下，研究人员转换了多种在特定赖氨酸位点突变的泛素突变体，以鉴定UBQLN1识别的泛素链类型。结果显示，当转换K48R突变体时，与UBQLN1结合的泛素化LCN2信号显著降低，表明UBQLN1特异性识别LCN2上连接的K48型多聚泛素链。
缺氧通过XBP1s上调MYDGF转录
研究发现，缺氧在mRNA和蛋白水平上均上调了MYDGF的表达。生物信息学分析预测XBP1s是结合MYDGF启动子的关键转录因子。功能实验证实，敲低XBP1s阻断了缺氧诱导的MYDGF上调，而过表达XBP1s则能增加其表达。通过JASPAR数据库预测和染色质免疫沉淀-定量PCR验证，确认XBP1s特异性结合在MYDGF启动子的BS2位点。双荧光素酶报告基因实验进一步证明，突变BS2位点可消除XBP1s对MYDGF启动子的激活作用。这些结果表明XBP1s直接转录激活MYDGF。
XBP1s通过MYDGF-LCN2轴抑制铁死亡
挽救实验表明，XBP1s通过MYDGF调控LCN2：XBP1s敲低降低LCN2，可被MYDGF过表达挽救；XBP1s过表达增加LCN2，可被MYDGF敲低阻断。最终，XBP1s敲低促进了铁死亡，表现为脂质活性氧和丙二醛水平升高，而这一效应可被过表达MYDGF或LCN2所逆转。综上，该研究完整地揭示了“缺氧-XBP1s-MYDGF-UBQLN1-LCN2”信号轴抑制胃癌细胞铁死亡的分子机制。
本研究通过整合多组学数据与功能实验，首次系统揭示并完整阐释了胃癌细胞在缺氧微环境下，通过一条全新的XBP1s–MYDGF–UBQLN1–LCN2信号轴来抑制铁死亡、促进生存的分子机制。该机制的阐明具有多重重要意义。在理论层面，它深化了对胃癌缺氧适应机制的理解，将缺氧应激、内质网应激、蛋白质稳态调控与铁死亡抵抗紧密联系起来，丰富了肿瘤细胞死亡调控的理论框架。特别是发现了UBQLN1通过内质网相关降解途径降解LCN2，以及MYDGF通过竞争性结合UBQLN1的STI1-4结构域来发挥保护作用的全新机制，拓展了关于泛素-蛋白酶体系统在铁死亡中作用的认识。在临床转化层面，这项研究为克服胃癌，尤其是晚期伴随缺氧微环境的胃癌的治疗耐药性提供了新的思路和潜在靶点。血浆中可检测的MYDGF和LCN2有望成为预测铁死亡诱导剂疗效的生物标志物。更重要的是，靶向XBP1s、MYDGF或UBQLN1-LCN2相互作用的抑制剂，与现有的铁死亡诱导剂或标准化疗/靶向疗法联用，有望成为逆转耐药、增强疗效的新型组合策略。尽管研究存在对临床样本验证不足、在其他癌种中的普适性有待探索等局限性，但它无疑为开发针对缺氧肿瘤微环境的新型抗癌疗法奠定了重要的理论基础，展示了通过靶向肿瘤代谢与细胞死亡交叉通路来改善胃癌患者预后的广阔前景。
