《International Journal of Molecular Sciences》：Urinary miRNA Analysis for Clear Cell Renal Cell Carcinoma: miR-20a as a Key Endogenous Normalizer
Giovanni Cochetti,
Giacomo Vannuccini,
Matteo Mearini,
Alessio Paladini,
Francesca Cocci,
Raffaele La Mura,
Daniele Mirra,
Giuseppe Giardino and
Ettore Mearini
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为解决尿液miRNA分析中因标准化策略不一致导致的可重复性与可比性差的问题，研究人员针对肾透明细胞癌（ccRCC）开展了尿液miR-20a作为内参正常化因子的稳定性和适用性研究。结果表明，miR-20a是尿液miRNA分析中最稳定的内参，其表达不受肿瘤分期、分级及尿液储存时间影响。该研究确立了miR-20a作为尿液miRNA液体活检的稳健内参，提升了检测的准确性，为ccRCC的无创诊断提供了可推广的标准化方法。
肾脏是我们身体里重要的“净化工厂”，每天辛勤工作，过滤血液，形成尿液。然而，这个工厂有时也会“生病”，其中肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）就是一种常见的肾脏恶性肿瘤。在肾细胞癌的诸多亚型中，透明细胞肾细胞癌（clear cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC）最为多见，占到了所有病例的65%至70%。这种癌症在早期往往不露声色，没有明显症状，导致许多患者在确诊时病情已进入中晚期，错过了最佳治疗时机。尽管影像学技术在不断进步，但仍有相当一部分病例是偶然发现的，甚至有些在诊断时已经发生了转移。因此，科学家们一直在寻找更灵敏、更便捷的方法，能够在癌症早期就发出警报，实现无创诊断。
在此背景下，液体活检（liquid biopsy）技术应运而生。它像是一种高明的“体液侦探”，通过分析血液、尿液等体液中的微量物质来捕捉疾病的蛛丝马迹。尿液，作为肾脏直接产生的排泄物，自然成为了研究肾癌的“富矿”。其中，微核糖核酸（microRNA, miRNA）这类小分子RNA备受关注。它们虽然个头小，但能量大，能调控大量基因的表达，并且在血液、尿液等体液中异常稳定，是理想的非侵入性生物标志物候选者。
然而，从尿液中发现可靠的癌症标志物并非易事。尿液成分复杂，其分子含量容易受到尿液浓度、饮水、饮食、肾功能甚至昼夜节律等多种生理和环境因素的影响，这给数据分析带来了巨大挑战。为了得到可靠的结果，研究人员在利用实时荧光定量PCR（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）等技术精确测量尿液中miRNA含量时，必须采用一种叫做“标准化”或“归一化”的数据校正方法。这个过程就像用一把标准的“尺子”去衡量目标物的长度，以消除技术误差和个体差异带来的波动。这把“尺子”在分子生物学中被称为“内参基因”或“内参正常化因子”。一个理想的内参应该在健康人和患者中稳定表达，不受疾病状态或治疗的影响。不幸的是，对于尿液miRNA分析，尤其是针对肾癌的研究，长期以来缺乏一个公认的、普适性强的内参miRNA。不同的研究使用不同的内参，导致研究结果之间难以比较和重复，极大地阻碍了尿液miRNA液体活检从实验室走向临床应用的步伐。
此前，J. Oto等人于2021年的研究首次提出miR-20a-5p在ccRCC患者尿液中具有作为内参的潜力。为了进一步验证这一发现，并将其应用于更贴近临床实际的情景——即样本无法立即处理，需要储存和运输的情况，由Giovanni Cochetti等人领导的研究团队开展了一项新的研究。他们的核心问题是：在使用了尿液稳定剂、样本可以室温保存的条件下，miR-20a是否仍然是一个稳定的内参？其稳定性是否会受到肿瘤的恶性程度（分期、分级）或样本储存时间的影响？这项研究旨在为建立可重复、可比对的尿液miRNA分析工作流程提供关键的技术支撑，相关成果发表在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上。
为回答上述问题，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，他们建立了包含99份尿液样本的队列，样本来源于47名健康个体、30名ccRCC患者（术前）以及22名术后患者，并使用了尿液稳定剂进行样本保存。其次，通过RT-qPCR技术对六种候选内参miRNA（miR-20a, miR-15b, miR-16, miR-15a, miR-210-3p, miR-let-7b）进行定量。最后，利用RefFinder在线工具（整合了geNorm、normFinder、BestKeeper和ΔCt四种算法）来系统评估和排名这些miRNA的表达稳定性，从而筛选出最稳定的内参。
研究结果
2.1. 基线人口统计学、样本特征及使用合成spike-in RNAs的技术质量控制
研究首先分析了人群的年龄和性别分布，未发现组间存在显著差异，表明样本分组均衡。同时，研究使用了合成的非人源spike-in RNA（Spike-in 2, Spike-in 4, Spike-in 6）来监控RNA提取和逆转录的效率。结果显示，所有临床组中这些spike-in的Ct值无显著差异，证实了从样本处理到逆转录整个流程的一致性和高效性。
2.2. 评估最佳miRNA正常化因子
为了从六种候选miRNA中找出最稳定的内参基因，研究使用了RefFinder工具进行综合分析。根据四种算法（Delta CT, BestKeeper, NormFinder, GeNorm）的综合排名，miR-20a表现出最高的稳定性，其几何平均数（Geometric Mean, GM）排名值为1.778，紧随其后的是miR-15b（GM = 1.861）。而miR-210-3p则在所有方法中均表现最不稳定（GM = 6.000）。
随后，研究对miR-20a的表达进行了详细的分布分析。夏皮罗-威尔克检验（Shapiro–Wilk test）显示，其在健康对照组、ccRCC术前组和术后组中的表达数据均符合正态分布（p > 0.05）。正态Q-Q图也显示观测值与期望正态分布线紧密贴合，进一步证实了其分布的正态性。
箱线图显示，miR-20a在三组中的表达水平相对稳定，没有显著的波动。单因素方差分析（one-way ANOVA）结果表明，三组间miR-20a的表达无统计学显著差异（F(2.96) = 2.324, p = 0.103）。事后多重比较（Tukey HSD和Bonferroni校正）也证实了组间无显著差异。此外，组内变异系数（Coefficient of Variation, CV%）很低，在4.98%到6.38%之间，表明其表达在不同个体间也非常一致。
2.3. miR-20a表达与病理、组织学肿瘤变量及储存天数的相关性
为了评估miR-20a作为内参是否受疾病特征影响，研究人员分析了其表达与肿瘤病理T分期、组织学分级（WHO/ISUP）以及尿液储存时间之间的关联。学生t检验（Student’s t-test）和斯皮尔曼等级相关分析（Spearman’s rank correlation）显示，miR-20a的表达水平在不同肿瘤分期（T1 vs. T2）组间无显著差异，与肿瘤分期、分级也无显著相关性（所有p值 > 0.05）。更重要的是，Spearman相关分析表明，miR-20a的Ct值与从尿液采集到RNA提取的天数之间没有显著关联，说明即使尿液样本经过较长时间的室温保存，其表达仍然保持稳定。
研究结论与讨论
本研究的核心结论是，在使用了尿液稳定剂的前提下，miR-20a是ccRCC患者尿液miRNA分析中一个高度稳定和可靠的内源性正常化因子。RefFinder的综合稳定性排名、正态分布检验、组间无差异的统计结果以及低变异系数，共同强有力地支持了这一结论。
这项研究的意义重大，它从多个维度推进了尿液miRNA液体活检的实用化进程。首先，它验证并扩展了J. Oto等人的前期发现，在更大的队列和使用了稳定剂的样本中确认了miR-20a的稳定性，使其结论更具普适性。其次，研究首次系统证明了miR-20a的表达不受ccRCC肿瘤分期和分级的影响，这意味着无论患者疾病处于何种阶段，都可以使用miR-20a进行数据校正，这对其作为通用内参至关重要。第三，也是最具临床应用价值的一点，研究发现miR-20a的表达不受尿液储存时间的影响。结合研究中使用的尿液稳定剂（可在室温下保护遗传物质长达两年），这为解决实际临床工作中样本无法即时处理的难题提供了完美方案。样本可以从偏远门诊或基层医疗机构采集，室温下运输至中心实验室进行分析，而无需昂贵的冷链设备，极大降低了开展大规模、多中心研究的门槛和成本。
当然，研究也存在一些局限性，例如样本量相对较小，缺乏晚期（>pT2期）和转移性肿瘤患者的样本，且研究主要来自少数中心。未来的研究需要在更大规模、更多中心的队列中进一步验证，并探索miR-20a在ccRCC以外的其他肾癌亚型以及转移性疾病中的适用性。
尽管如此，本研究为建立标准化、可重复的尿液miRNA分析工作流程迈出了关键一步。通过确立miR-20a作为稳健的内参，并辅以尿液稳定剂的预处理方案，有望显著减少不同研究间的变异性，提高尿液miRNA检测的准确性和可重复性，从而加速基于尿液的无创液体活检技术在肾癌早期诊断、预后评估和疗效监测中的临床应用转化。
