《International Journal of Molecular Sciences》：Development and Validation of an Ion-Pair Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography–Electrospray Ionization Mass Spectrometry Method for Determination of Purity of Nusinersen for Quality Control of Drug Substance or Drug Product
Mikhail Samoilov,
Ekaterina Zubareva and
Maksim Degterev
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为应对合成寡核苷酸药物杂质谱分析的挑战，研究人员优化并验证了一种离子对反相高效液相色谱-电喷雾电离质谱（IP-RP-HPLC-ESI-MS）方法，用于通用型nusinersen原料药和制剂的纯度控制。该方法成功应用于nusinersen及其相关杂质的鉴定与定量，检测限（LoD）和定量限（LoQ）分别达到2.5×10?5mg/mL和4.9×10?5mg/mL，线性良好（R2≥ 0.9669）。这项研究填补了寡核苷酸杂质分析的关键空白，为相关药物的质量控制和患者安全提供了可靠的分析工具。
在精准医疗的时代，核酸药物正以高特异性、高效能和低毒性的特点，成为治疗许多罕见病的新希望。其中，nusinersen作为一款反义寡核苷酸药物，已成功用于治疗脊髓性肌萎缩症，通过上调运动神经元生存蛋白的水平，为患者带来了曙光。然而，与所有合成药物一样，确保其纯度与安全性是药物研发和生产的核心环节。合成寡核苷酸，特别是像nusinersen这样经过化学修饰（如全部磷酸键被替换为磷酸硫代酯）的分子，其生产过程会不可避免地引入多种结构相近的杂质，例如缺少或多出核苷酸的“短链/长链”杂质，以及磷酸硫代酯氧化为磷酸二酯等降解产物。这些“李鬼”与“本尊”的理化性质极为相似，常常“隐藏”在主峰中，传统的色谱方法难以将它们一一分辨。但即使是微小的结构差异，也可能影响药物的疗效与安全性。因此，开发一种能够“火眼金睛”般精准识别和定量这些杂质的分析方法，对于保障药物质量、优化生产工艺乃至守护患者安全，都至关重要。这正是发表在《International Journal of Molecular Sciences》上的一项研究所要解决的核心问题。
为了攻克这一难题，研究人员系统性地开发并验证了一套基于离子对反相高效液相色谱-电喷雾电离质谱（IP-RP-HPLC-ESI-MS）的分析方法。该方法主要运用了以下关键技术：首先，色谱条件优化，通过筛选色谱柱（最终选用ACQUITY Premier BEH C18 Oligonucleotide柱）和优化流动相组成（含三乙胺和六氟异丙醇），以提升分离效率和减少样品吸附。其次，质谱条件优化，细致调节了电喷雾电压、干燥气/聚焦气压力、去簇电压和碰撞能量等参数，以最大化目标信号并最小化加合物干扰。再次，复杂数据处理，利用专业软件（Byos, Sciex OS）进行质谱去卷积、提取离子色谱图处理和杂质鉴定，以区分真实杂质与仪器假象。最后，全面的方法学验证，对方法的特异性、线性、检测限/定量限、精密度、准确度和耐用性进行了系统评估，确保其适用于常规质量控制。
结果与讨论
2.1. 高效液相色谱条件的初步选择
在方法开发初期，研究人员设定了平滑基线、无假峰、色谱轮廓稳定等视觉评估标准。在后期，进一步将nusinersen峰的不对称性、信噪比以及nusinersen与其n-2杂质提取离子色谱峰之间的分离度纳入考量。
2.2. 色谱柱的选择
研究比较了Waters的ACQUITY UPLC C18柱和ACQUITY Premier BEH Oligonucleotide柱。结果发现，寡核苷酸在C18柱上可能存在较强吸附，导致峰面积重复性变差。而ACQUITY Premier BEH C18 Oligonucleotide柱在减少吸附、提高分离效率和色谱分离度方面表现更优。通过使用更高浓度的流动相（15 mM TEA, 400 mM HFIP），进一步降低了吸附并维持了系统压力稳定性。因此，后续研究选用了ACQUITY Premier BEH C18 Oligonucleotide柱。
2.3. 质谱条件优化
针对大分子质谱分析的不稳定性和易形成加合物的特点，研究人员对离子化条件进行了精细优化。最终确定ESI针电压为4500 V，干燥气和聚焦气压力为70 psi，此时在最小化加合物离子信号的同时获得了最佳强度。去簇电压优化为60 V，以最大化nusinersen信号与加合物信号的差异。碰撞能量优化为7 V，在避免碎片化的前提下实现了目标信号与加合物信号的最佳平衡。
2.4. 数据收集与处理
利用Byos和Sciex OS软件处理数据。通过去卷积质谱图，研究人员鉴定出了nusinersen的主要杂质。为了区分真实杂质与仪器假象，他们采用了两种策略：一是分析信号线性，发现假象信号与浓度无线性关系；二是比较纯化样品、合成后未纯化样品以及强制氧化样品中的杂质含量变化，真实杂质含量会因工艺或处理而变化，而假象则保持稳定。通过这些手段，最终确定了nusinersen样品中存在的可靠杂质列表。
2.5. 主要杂质的色谱行为
研究发现，不同杂质的色谱行为存在显著差异，这取决于结构变化在寡核苷酸链中的位置和空间构象。例如，末端的P=S向P=O（磷酸硫代酯氧化为磷酸二酯）取代会减少保留时间，而内部的相同取代则因被屏蔽而影响较小。核苷酸缺失杂质（n-1, n-2等）的保留时间也呈现序列依赖性。通过向nusinersen中添加不同浓度的已知杂质混合物，验证了该方法在测定杂质含量方面的准确性和线性，杂质峰面积与其实际含量成比例增加。
2.6. 样品制备的影响
研究发现，不进行样品制备（如脱盐和缓冲液置换）会导致系统压力升高、色谱分离度下降，甚至引起保留时间漂移。然而，比较经过样品制备和未经制备的样品，其杂质相对含量并无统计学显著差异，表明样品制备的主要作用是保护仪器和维持分析稳定性，而非改变测定结果。
2.7. 方法验证
该方法通过了全面的验证：
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特异性：能够区分nusinersen、空白及主要杂质。
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线性、检测限与定量限：nusinersi的提取离子色谱信号在9.6–1.0×10?5mg/mL浓度范围内线性良好（R2> 0.99），检测限和定量限分别低至2.5×10?5mg/mL和4.9×10?5mg/mL。各杂质的提取离子色谱信号也显示出可接受的线性。
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精密度：重复性（单次运行内）和重现性（不同分析员、不同日期、不同仪器间）测试表明，对于含量高于1.0%的杂质，相对标准偏差（RSD）均低于可接受标准，方法精密度良好。
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耐用性：在三种不同的高效液相色谱-质谱联用系统（Agilent-Sciex, Waters-Sciex, Shimadzu-Thermo）上应用该方法，所得nusinersen及主要杂质的相对含量结果具有良好的一致性，表明方法在不同平台间具有稳健性。此外，对柱温、离子源温度等关键参数进行微小变动，也未对杂质分析结果产生显著影响。
结论与讨论
本研究成功开发并验证了一种用于测定治疗性寡核苷酸药物nusinersen纯度的IP-RP-HPLC-ESI-MS方法。该方法具有高选择性、高灵敏度和良好的耐用性，能够有效鉴定和定量nusinersen原料药及制剂中多种结构相似的产品相关杂质和工艺相关杂质，如不同位置的P=O氧化产物、n-1/n-2/n+1等链长变异体。
该研究的重要意义体现在多个层面。在技术方法学上，它系统探索并优化了适用于合成寡核苷酸，特别是全硫代磷酸酯修饰的复杂分子的LC-MS分析条件，包括色谱柱选择、离子对试剂运用、质谱参数优化等，为同类药物的分析提供了详实的参考范本。在质量控制实践中，这套经过全面验证的方法能够用于药物的常规纯度监测、稳定性研究、强制降解测试以及生产工艺（如合成与纯化）的评估与优化，直接助力于生产出高纯度的最终产品。在药物研发与安全层面，精准的杂质谱分析有助于理解药物的降解途径，从而指导更稳定的处方设计和储存条件的建立，从源头控制风险，最终保障患者的用药安全。
尽管该方法针对nusinersen开发，但其整体策略、遇到的技术挑战及解决方案，对广大致力于其他合成寡核苷酸药物质量研究的制药企业和分析实验室而言，具有重要的借鉴和启发价值。
