PgWRKY44介导的SA/JA通路调控增强珍珠粟和水稻对稻瘟病的抗性

《Plant Signaling & Behavior》：PgWRKY44-mediated modulation of SA/JA pathways enhances blast pathogen resistance in pearl millet and rice

　　

摘要 植物响应多种胁迫条件的复杂防御网络通常受到多种转录因子(TFs)的严密调控。这些转录因子可通过结合其相应的顺式作用元件来改变其靶基因的表达。许多研究已对拟南芥、水稻和烟草等植物中不同WRKY转录因子在各种胁迫条件下的功能进行了表征。然而，它们在一个主要的C4作物（如珍珠粟）中的作用仍不明确。研究人员先前的研究表明，在拟南芥中异位表达IId组成员PgWRKY44可增强对干旱和盐碱条件的耐受性。然而，结合启动子in silico分析以及施用水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)后的GUS报告基因检测，表明其可能参与生物胁迫抗性。转录谱分析显示，PgWRKY44在病原体侵染和植物激素处理期间表达增强，表明其参与激素介导的防御通路。为进一步研究其作用，研究人员在珍珠粟和水稻中均构建了过表达PgWRKY44的转基因株系，这些株系对半活体营养型真菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)表现出更强的抗性，表现为病斑形成减少以及多个防御相关基因表达水平的显著变化。转基因株系在水杨酸(SA)通路（如NH1、ICS1和PAD4）和茉莉酸(JA)通路（如PR10、LOX和AOS2）中的关键基因表达均升高，凸显了PgWRKY44在调控激素串扰以调节针对稻瘟病菌侵染的防御反应中的潜在作用。综上所述，研究人员的发现确立了PgWRKY44作为非生物和生物胁迫响应的双重调节因子，并证明了其在构建抗病、气候适应性强的谷类作物中的效用。

研究背景与目的

植物面临着包括非生物和生物胁迫在内的多种环境挑战。生物胁迫，特别是由病原真菌、细菌、病毒和线虫引起的侵染，对全球农业生产构成重大威胁。植物演化出了复杂的防御机制，其核心是一个信号转导通路网络，其中转录因子(TFs)扮演着关键角色。WRKY转录因子因其在介导病原特异性和广谱抗性机制中的作用，已成为植物免疫反应的关键调节因子。它们能够识别下游靶标启动子中的W-box元件，并常在病原攻击和水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等与防御相关的激素信号通路中被快速激活。尽管已在拟南芥、水稻等模式植物中对多个WRKY蛋白进行了广泛的功能研究，但对于珍珠粟(Pennisetum glaucum)这类气候适应性谷类作物中WRKY的功能知之甚少。珍珠粟是一种营养丰富的C4作物，对干旱和半干旱气候条件适应性强，在气候变化背景下具有可持续农业的巨大潜力。然而，其对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等病原体的易感性仍是限制其生长和产量的主要问题。研究人员先前鉴定了一个来自珍珠粟的IId组WRKY转录因子基因PgWRKY44，并证明其在拟南芥中异位表达可增强对盐、旱、热等非生物胁迫的耐受性。通过对PgWRKY44启动子的分析，发现了多个与生物胁迫相关的顺式调控元件(CREs)，暗示其可能参与生物胁迫响应。为了填补这一知识空白，并探究其在实际作物抗病育种中的应用潜力，本研究旨在深入探究PgWRKY44在稻瘟病防御机制中的功能角色及其分子调控网络。

主要技术方法概述

本研究采用了分子生物学、遗传转化和生理生化分析相结合的策略。首先，对珍珠粟不同组织及在稻瘟病菌(M. grisea)侵染、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下的PgWRKY44表达模式进行了定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。其次，通过in silico分析和基于GUS报告基因的启动子活性测定，验证了PgWRKY44启动子在激素及病原处理下的响应性。核心工作是利用农杆菌介导法和多肽介导转化法，分别在珍珠粟(cv. 7042S)和水稻(cv. IR64)中构建了过表达PgWRKY44的T₃代纯合转基因株系。通过病原体点接种试验评估转基因植株的稻瘟病抗性表型。最后，利用qRT-PCR技术系统分析了转基因植株在病原挑战下，抗氧化基因(CAT, POD, SOD)、病程相关(PR)基因以及SA/JA信号通路关键基因（如NH1, ICS1, PAD4, LOX, AOS2）的表达变化，以阐明PgWRKY44调控的防御信号通路。

研究结果

1. PgWRKY44在不同植物组织中的表达及其对病原和植物激素处理的响应

表达谱分析显示，PgWRKY44在珍珠粟所有组织中均有表达，其中叶片中表达量最高。稻瘟病菌侵染可显著诱导PgWRKY44转录本积累，在处理后3天达到峰值。外源施用SA和MeJA也能显著上调PgWRKY44的表达。这些结果表明PgWRKY44可能参与了对病原侵染的响应以及SA和JA介导的防御信号通路。

2. PgWRKY44启动子在胁迫条件下的表征

对PgWRKY44上游1000 bp启动子区的in silico分析发现了多个与生物胁迫响应相关的CREs，如W-box、MeJA响应元件(TGACG-motif)和SA响应元件(as-1)。GUS组织化学染色实验进一步证实，与对照相比，用MeJA、SA和稻瘟病菌处理的瞬时转化水稻愈伤组织中，PgWRKY44启动子驱动GUS报告基因的活性增强。这从转录激活层面支持了PgWRKY44参与激素和病原响应的推测。

3. PgWRKY44在珍珠粟和水稻中的组成型表达赋予对稻瘟病菌的抗性

研究人员成功获得了过表达PgWRKY44的珍珠粟和水稻T₃纯合转基因株系。病原点接种试验表明，与野生型相比，转基因珍珠粟和水稻叶片在接种稻瘟病菌后形成的病斑显著减少，表现出更强的抗病性，且无明显生长缺陷。这直接证明了PgWRKY44的过表达能增强作物对稻瘟病的抗性。

4. 病原挑战过程中抗氧化基因的表达谱分析

在未处理（模拟）条件下，转基因水稻和珍珠粟株系中过氧化氢酶(CAT)的基线表达水平显著高于野生型。病原侵染后，转基因植株中过氧化物酶(POD)的表达被诱导，而在野生型中其表达降低或不变。超氧化物歧化酶(SOD)的表达在各样品中大多未受影响。这表明PgWRKY44的过表达可能通过调节抗氧化酶系统，特别是增强CAT的基线水平和病原诱导的POD表达，来帮助维持活性氧(ROS)稳态，从而减轻病原侵染引起的氧化损伤。

5. PgWRKY44调控的防御机制相关基因的表达谱分析

在过表达PgWRKY44的转基因水稻中，病原挑战显著诱导了JA通路标志基因PR10的表达，而SA通路标志基因PR1α的表达总体上受到抑制或不变。进一步分析SA和JA生物合成及信号通路的关键基因发现，SA通路中的NH1、ICS1和PAD4在转基因水稻病原处理后表达显著上调，而PAL的表达未受病原影响且在转基因植株中较低。同时，JA生物合成基因LOX和AOS2在病原处理的转基因植株中表达上调。这些结果表明，PgWRKY44可能通过激活SA生物合成（通过异分支酸途径）的同时，抑制下游部分SA信号（如PR1），并增强JA介导的防御反应，从而协调SA和JA通路的串扰，共同对抗稻瘟病菌侵染。

讨论与结论总结

本研究通过系统的功能分析，证实了珍珠粟IId组WRKY转录因子PgWRKY44在稻瘟病抗性中的关键作用。讨论部分指出，PgWRKY44的表达受病原和SA/JA激素诱导，其启动子含有相应的响应元件。过表达PgWRKY44能通过调节SA和JA信号通路的基因表达网络来增强抗病性，特别是激活JA通路（PR10, LOX, AOS2）和SA生物合成上游基因（ICS1, PAD4），同时抑制下游SA信号标志物PR1的表达，这表明其可能通过偏向激活JA通路来协调防御反应。此外，PgWRKY44还通过调控抗氧化酶基因（如CAT和POD）的表达，帮助维持病原侵染过程中的ROS平衡。研究人员还发现，PgWRKY44的过表达降低了丝裂原活化蛋白激酶MPK3/MPK6同源基因的基线表达，这可能与增强的抗性表型有关。这些发现将PgWRKY44的功能从已知的非生物胁迫耐受性扩展到了生物胁迫抗性，确立了其作为双重胁迫响应调节因子的地位。

结论翻译

总之，对来自珍珠粟的IId组WRKY转录因子PgWRKY44及其1000 bp上游启动子区的深入分析，证明了其在抵抗稻瘟病菌胁迫中的重要作用。通过在珍珠粟和水稻中过表达PgWRKY44，研究人员强调，PgWRKY44通过调节在SA和JA信号通路中起重要作用的关键基因来增强疾病抗性。此外，启动子分析和不同胁迫条件下的表达谱分析支持了PgWRKY44在生物胁迫期间的诱导性和调控潜力。虽然研究人员检测了转基因水稻植株中参与激素信号通路的基因转录水平，但仍需对转基因珍珠粟进行进一步研究，以确定是否在不同物种间遵循类似的防御信号模式。启动子工程和利用CRISPR-Cas系统潜力的靶向基因编辑，可以利用PgWRKY44的调控潜力，以更可控的方式定制植物防御反应。此外，PgWRKY44在非生物和生物胁迫耐受性方面的双重功能，凸显了其作为作物改良计划中一个有前途的候选基因的价值，用于培育气候适应性强、抗病的谷类作物。