《Platelets》：Platelet-rich plasma concentrations regulate MSCs osteogenesis via MAPK/PI3K–AKT pathways to mitigate inflammatory bone loss
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骨通过破骨细胞和成骨细胞的协调作用维持动态稳定状态。成骨细胞主要来源于间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC），负责骨形成。成骨细胞增殖和分化的抑制涉及许多疾病，包括骨质疏松症、骨关节炎、感染性骨缺损和植入物无菌性炎症松动。鉴于目前
骨通过破骨细胞和成骨细胞的协调作用维持动态稳定状态。成骨细胞主要来源于间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC），负责骨形成。成骨细胞增殖和分化的抑制涉及许多疾病，包括骨质疏松症、骨关节炎、感染性骨缺损和植入物无菌性炎症松动。鉴于目前治疗方案有限，探索促进骨形成的新方法是骨科医生关注的重要焦点。富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma, PRP）是一种富含多种生长因子的自体物质，在再生医学中广泛应用。然而，PRP对炎症性骨破坏的影响仍不清楚。研究人员研究了PRP对MSC活力的影响，以及不同浓度PRP（分别为1%和3%）对细胞死亡、增殖和分化的影响。此外，研究人员在体内测试了不同浓度PRP（1%和3%）对脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症性骨破坏的治疗效果。PRP增强了MSC的细胞活性并促进成骨。较高浓度的PRP（3%）主要通过PI3K/AKT通路减少LPS处理的MSC的死亡并增加其增殖，而较低浓度的PRP（1%）则通过MAPK通路促进MSC分化为成骨细胞。与体外实验一致，研究人员在体内通过增加骨形成验证了PRP对LPS诱导的骨丢失的保护作用。这些结果表明，不同浓度的PRP可以通过不同的机制改善LPS诱导的炎症性骨丢失。
炎症性骨破坏是包括骨质疏松、骨关节炎、骨缺损感染和植入物无菌性松动在内的多种骨科疾病的共同病理过程，其治疗选择目前有限。骨稳态由成骨的间充质干细胞（MSC）-成骨细胞系和破骨的单核-巨噬-破骨细胞系共同维持。在炎症状态下，炎症因子不仅刺激破骨细胞生成，还会诱导MSC凋亡并抑制成骨细胞分化，导致骨丢失。富血小板血浆（PRP）作为一种富含多种生长因子的自体血液制品，已被广泛用于组织再生与修复。然而，PRP对炎症性骨破坏的具体作用尚不明确，特别是不同浓度的PRP是否对成骨细胞具有不同效应及其分子机制，亟待研究验证。为此，本研究旨在探究PRP对LPS诱导的炎症性骨破坏模型的影响，并阐明其潜在机制。
本研究发表在期刊《Platelets》上。研究人员通过体外细胞实验和体内动物模型，系统研究了不同浓度PRP（1%和3%）在LPS诱导的炎症环境下对MSC的调控作用及其分子通路。研究得出的主要结论是，PRP能有效缓解LPS诱导的MSC毒性，并通过激活不同的信号通路发挥促增殖和促成骨分化作用。具体而言，高浓度PRP（3%）主要通过激活PI3K/AKT通路减少细胞死亡、促进增殖；而低浓度PRP（1%）则主要通过激活MAPK通路促进MSC向成骨细胞分化。体内实验进一步证实，PRP能够减轻LPS诱导的大鼠颅骨骨丢失，促进骨形成。这项研究揭示了PRP浓度依赖性的双重作用机制，为临床治疗炎症性骨丢失提供了新的策略依据，具有重要意义。
为开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术方法。研究使用了来自成年雄性Sprague Dawley大鼠的血液制备PRP，并通过两步离心法确保血小板富集浓度达到全血的5倍以上。从大鼠股骨和胫骨中分离并鉴定了MSC，通过流式细胞术检测其表面标志物（CD90、CD29、CD44阳性，CD11b、CD34、CD45、CD19阴性）并证实其成骨分化潜能。体外研究通过CCK-8法、活/死细胞染色、EdU染色评估细胞活力、死亡和增殖；通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色及Western blot（检测胶原蛋白I、Runx2、SP7表达）评估成骨分化。利用磷酸化蛋白微阵列技术分析了PRP处理后MSC内信号通路的磷酸化变化，并通过qPCR验证了MAPK和PI3K/AKT通路相关基因（如Fos、Jun、Arrb1、Akt1、Mtor、Mdm2）的表达。体内研究则建立了LPS诱导的大鼠颅骨骨溶解模型，通过微计算机断层扫描（micro-CT）分析骨量参数（骨体积分数BV/TV、孔隙率），并通过免疫荧光染色检测颅骨切片中胶原蛋白I和SP7的表达，以评估PRP对骨形成的保护作用。
结果
PRP缓解LPS诱导的MSC细胞毒性
研究人员成功从大鼠骨髓中分离出MSC，并证实其具有典型的表面标志物表达谱和成骨分化能力。ELISA检测显示PRP中富含TGF-β1和PDGF-BB生长因子。CCK-8实验表明，LPS浓度大于40 μg/mL时会显著降低MSC活力。PRP处理能保护MSC免受LPS诱导的细胞毒性，其中3% PRP的保护作用最强，而1% PRP对细胞数量无显著影响。
不同PRP浓度正向调控LPS刺激下MSC的成骨
ALP和茜素红染色结果显示，无论是否存在LPS刺激，PRP（1%和3%）均能显著增加MSC的ALP活性和钙结节形成，表明PRP能促进MSC的成骨分化和成骨活性。在40 μg/mL LPS（轻度炎症）条件下，3% PRP诱导的ALP染色强于1% PRP。
3% PRP处理通过减少细胞死亡和促进增殖来增强MSC活力
活/死细胞染色和EdU实验表明，3% PRP能减少LPS处理的MSC死亡并促进其增殖，而1% PRP对LPS诱导的MSC死亡和增殖无显著影响。这表明高浓度PRP主要通过增强细胞存活和增殖来提升MSC活力。
较低PRP浓度（1%）在炎症条件下促进MSC的成骨分化
Western blot分析显示，1% PRP能上调LPS刺激下MSC中成骨关键蛋白（胶原蛋白I、Runx2、SP7）的表达，促进其分化。而3% PRP对MSC的成骨分化无显著影响。这表明低浓度PRP主要促进MSC的成骨分化。
PRP浓度通过MAPK和PI3K/AKT通路差异调控MSC命运
磷酸化蛋白微阵列分析发现，不同浓度PRP处理导致MSC中大量蛋白质磷酸化水平发生差异变化。KEGG富集分析显示，差异磷酸化蛋白主要富集在PI3K/AKT和MAPK信号通路。进一步分析表明，1% PRP组上调的磷酸化蛋白主要与MAPK通路相关，而3% PRP组上调的蛋白则主要与PI3K/AKT通路相关。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析将Tp53和Akt1分别确定为MAPK和PI3K/AKT网络中的关键节点基因。qPCR结果证实，1% PRP处理上调了MAPK通路下游基因Fos、Jun和Arrb1的表达，而3% PRP处理则上调了PI3K/AKT通路基因Akt1、Mtor和Mdm2的表达。这些结果表明，低浓度PRP主要通过激活MAPK通路促进分化，而高浓度PRP主要通过激活PI3K/AKT通路促进增殖和存活。
PRP在体内预防炎症性骨溶解
在大鼠颅骨骨溶解模型中，micro-CT分析显示，PRP（1%和3%）处理能显著防止LPS引起的骨体积分数下降和孔隙率增加，对LPS诱导的骨丢失具有保护作用。免疫荧光染色显示，PRP处理组颅骨中胶原蛋白I和SP7的表达增加，表明PRP在体内也能促进成骨。1%和3% PRP在体内的骨保护效果无显著差异。
讨论
本研究对PRP在炎症性骨丢失中的作用进行了深入探讨。PRP中富含多种生长因子，本研究所用PRP的血小板浓度超过全血5倍，符合标准。研究确认了LPS对MSC活力的抑制作用以及PRP的保护效应，且该效应并非线性剂量依赖。ALP和茜素红染色证实PRP能促进MSC的成骨活性。机制上，活/死染色、EdU和Western blot结果共同揭示，3% PRP主要促进MSC增殖，而1% PRP主要促进其分化。磷酸化蛋白微阵列和通路分析从分子层面证实，这种浓度依赖性差异效应是通过激活不同的核心信号通路实现的：1% PRP主要激活MAPK通路促分化，3% PRP主要激活PI3K/AKT通路促增殖。体内实验进一步验证了PRP的骨保护作用。研究也指出了本工作的局限性，例如PRP制备中涡旋步骤可能导致血小板预激活、未对PRP中白细胞亚群进行表型分析、未明确PRP中何种具体成分起主导作用，以及未探讨PRP对血管生成的影响。这些均为未来研究指明了方向。
结论
研究人员成功制备了标准化PRP并揭示了其双重作用机制。研究表明，PRP能增强LPS诱导的炎症环境中MSC的活力，并促进其ALP和钙结节表达。较高浓度PRP（3%）促进MSC增殖，而较低浓度PRP（1%）促进其分化。机制研究表明，较低浓度PRP激活MAPK通路，而较高浓度PRP激活PI3K/AKT通路。最后，micro-CT和组织学分析同样揭示了PRP在体内对LPS诱导的骨溶解的保护作用。总之，本研究表明，不同浓度的PRP通过不同的机制保护骨骼免受炎症破坏。
