一种新型德里金属β-内酰胺酶的共价抑制剂的发现与特性研究

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Discovery and Characterization of a Covalent Inhibitor of New Delhi Metallo β-Lactamase

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NDM-1的新型共价不可逆抑制剂研究，发现异喹啉和羟基喹啉衍生物通过修饰活性位点Lys211和Cys208实现高效抑制，其中化合物6显示饱和动力学特征。

　　

作者：Dann D. Rivera、John M. Schroeder、Jada N. Walker、Aarti Bashyal、Ayush G. Iyer、Ryan H. Lee、Trevor R. Melkonian、Jennifer S. Brodbelt、Walter Fast、Christian P. Whitman

美国德克萨斯大学奥斯汀分校药学院化学生物学与药物化学系，奥斯汀，德克萨斯州78712

摘要

新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）使细菌对多种β-内酰胺类抗生素产生抗性，包括最后手段的碳青霉烯类抗生素。NDM-1活性位点缺乏亲核性丝氨酸，使其对用于治疗β-内酰胺类耐药细菌的常规β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。本文报道了两种新的共价不可逆抑制剂，它们针对NDM-1活性位点中两个高度保守的亲核残基。N-丙烯酰-N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（2）以时间和浓度依赖的方式抑制NDM-1，且没有表现出饱和动力学（k_inact/K_I = 4.6 ± 0.1 M^-1s^-1）。定点突变和紫外光解（UVPD）质谱分析显示活性位点中的高度保守的赖氨酸（Lys211）发生了修饰。由于没有饱和动力学现象以及底物转化不完全，我们开发了N-(8-羟基喹啉-2-基)丙烯酰胺（6），它在丙烯酰胺亲电基团上添加了一个不同的金属结合基序。化合物6也以时间和浓度依赖的方式抑制NDM-1，并表现出饱和动力学（K_I = 167 ± 40 μM，k_inact = 0.12 ± 0.01 min^-1，k_inact/K_I = 12.0 ± 3.0 M^-1s^-1）。定点突变和UVPD质谱分析显示活性位点中的锌配位半胱氨酸（Cys208）发生了修饰。这些结果表明，丙烯酰胺可以用作亲电头，靶向NDM-1活性位点中的亲核残基。此外，这些抑制剂是设计共价抑制剂的有希望的骨架，可以作为辅助药物，恢复治疗表达NDM的细菌时β-内酰胺类抗生素的疗效。

引言

β-内酰胺类抗生素用于治疗多种细菌感染，是全球最常用的抗菌药物类别。然而，由于β-内酰胺水解酶（称为β-内酰胺酶）的进化，细菌耐药性的增加威胁到了它们的临床疗效。β-内酰胺酶的活性位点通常含有一个保守的催化丝氨酸，该丝氨酸在β-内酰胺底物的水解过程中起亲核作用。作为共价抑制剂的辅助药物（如克拉维酸）与β-内酰胺类抗生素一起使用，以恢复其疗效并对抗这种耐药性。然而，一类新的β-内酰胺酶——金属β-内酰胺酶（MBLs）对这种方法构成了威胁。MBLs的活性位点含有两个锌离子，这些锌离子与一个氢氧根分子配位，使其对常规β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。最广泛分布的MBL是新德里金属β-内酰胺酶（NDM），其非选择性的活性位点使细菌对多种β-内酰胺类药物产生抗性，包括最后手段的碳青霉烯类抗生素。此外，携带bla_NDM-1基因的质粒可以在不同细菌菌株之间转移，导致多种细菌物种产生多重耐药性。这尤其令人担忧，因为目前尚无FDA批准的药物能够对抗NDM的活性，这使得碳青霉烯类耐药细菌被疾病控制与预防中心（CDC）列为“紧急威胁”类别。因此，设计新的抑制剂作为辅助药物来治疗表达NDM的细菌至关重要。

NDM的浅层、非选择性活性位点使得开发能够有效竞争已给药β-内酰胺的不可逆抑制剂变得复杂。因此，我们设计了共价抑制剂，因为它们在靶向像NDM-1这样的酶时具有多个优势：共价抑制剂在与任何已给药的β-内酰胺反应时竞争较少，并且抑制效果会随时间增加。此外，共价相互作用的性质允许长时间抑制酶的活性。这减少了在感染部位维持药物饱和浓度的需要。最后，研究表明它们能够有效靶向浅层、非选择性的活性位点。由于NDM活性位点缺乏亲核性丝氨酸，必须靶向活性位点中的其他亲核残基。

NDM含有两个高度保守的残基，可以作为共价靶向的亲核剂：Cys208，它与活性位点中的一个锌离子配位，这对催化至关重要；以及Lys211，它与大多数β-内酰胺类抗生素上的2-羧基团相互作用。

已有报道多种针对这两个残基的共价抑制剂，如头孢克洛、O-芳氧基羰基羟胺和ebselen。然而，所有先前报道的共价抑制剂都存在选择性差的问题，这限制了它们的临床应用。因此，开发新型共价抑制剂将有助于克服这些障碍。

我们之前报道过五氟苯基-3-巯基丙酸酯（P3M）通过共价修饰Lys211来抑制NDM。P3M由一个巯基团和一个五氟苯基酯组成，巯基团与NDM-1活性位点的锌离子相互作用，而五氟苯基酯作为亲电头。然而，质谱分析表明P3M会修饰NDM-1中的多个残基。这一观察表明，五氟苯基酯作为选择性共价抑制剂的亲电头过于活泼。此外，与活性位点锌离子配位的巯基团可能导致脱靶效应和稳定性较差。因此，我们设计了一组抑制剂，由一个较少反应性的亲电基团连接到了一个不太活泼的金属结合基团上。结果是一系列杂原子取代的喹啉（金属结合基团）连接到丙烯酰胺（亲电头）上。本文报道了两种满足这些条件的共价抑制剂的合成和表征。第一种是N-丙烯酰-N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（2），它通过共价修饰Lys211来抑制NDM（k_inact/K_I = 4.6 ± 0.1 M^-1s^-1）。第二种是N-(8-羟基喹啉-2-基)丙烯酰胺（6），它通过修饰Cys208来抑制NDM（K_I = 167 ± 40 mM，k_inact = 0.12 ± 0.01 min^-1，k_inact/K_I = 12 ± 3 M^-1s^-1）。虽然还需要进一步优化这些抑制剂，但它们作为共价抑制剂骨架，可以靶向NDM-1中高度保守的残基，有助于开发恢复β-内酰胺类抗生素疗效的辅助药物。

实验方法

N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（1）和N-丙烯酰-N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（2）的合成：将一个经过烘烤干燥的烧瓶装上磁力搅拌棒，用橡胶塞密封，并用氮气冲洗。向20毫升无水THF中加入1-氨基异喹啉（100毫克，1.4毫摩尔，1.0当量）和三乙胺（194毫升，1.4毫摩尔，1.0当量），然后冷却至0°C。随后逐滴加入丙烯酰氯（169.5毫升，2.1毫摩尔，1.5当量）。1小时后，通过薄层色谱法验证产物的形成。

N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（1）和N-丙烯酰-N-(异喹啉-1-基)丙烯酰胺（2）的合成

选择异喹啉骨架的原因是观察到异喹啉及相关杂芳香族骨架通过金属配位和疏水性活性位点相互作用来抑制锌依赖性酶。因此，我们推测异喹啉中的氮原子可以与NDM-1中的二核Zn²⁺进行金属配位，而芳香环部分可以与活性位点中的疏水性残基相互作用。

结论

我们报道了两种新型NDM-1共价不可逆抑制剂（化合物2和6）的发现和表征。这些抑制剂是通过将丙烯酰胺（亲电头）连接到杂原子取代的喹啉上而开发的，这些喹啉作为NDM-1的金属结合抑制剂骨架。化合物2通过修饰与大多数β-内酰胺类抗生素上的羧基团相互作用的活性位点高度保守的赖氨酸（Lys211）来抑制NDM-1。

CRediT作者贡献声明

Trevor R. Melkonian：方法学。 Jennifer S. Brodbelt：方法学、资金获取、正式分析。 Walter Fast：项目管理、概念构思。 Dann D. Rivera：写作——初稿、方法学、研究。 John M. Schroeder：方法学。 Christian P Whitman：写作——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、资金获取、正式分析、数据管理。 Ayush G. Iyer：方法学。 Ryan H. Lee：方法学。 Jada N. Walker：

未引用参考文献

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注释

作者声明没有竞争性财务利益。

资助

感谢美国国立卫生研究院（R35GM13965）对J.S.B的资助，以及Robert A. Welch基金会（资助号F-1155给J.S.B和F-1225给C.P.W）的资助。

致谢

作者将本文献给我们亲爱的同事Walter Fast教授的纪念。我们感谢Michael Crowder教授（俄亥俄州牛津市迈阿密大学）提供的有益讨论。