用于I类HDAC共抑制物复合物冷冻电镜可视化的HDAC抑制剂–纳米金(nanogold)探针的合成

《Beilstein Journal of Organic Chemistry》：Synthesis of a HDAC inhibitor–nanogold probe for cryo-EM visualization in class I HDAC co-repressor complexes

　　

I类组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC 1–3）作为七种多功能蛋白共抑制物复合物中的催化亚基发挥作用，各复合物在细胞中具有不同功能。研究人员报道了以I类HDAC抑制剂CI-994为母体合成的HDAC抑制剂–纳米金（nanogold）探针，用于冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）下观察I类HDAC共抑制物复合物中HDAC催化结构域。该纳米金探针对HDAC1–LSD1–CoREST复合物体外抑制活性与CI-994相当。cryo-EM研究中，二维（2D）分类平均图显示出CoREST复合物的双叶（bi-lobed）构象，并部分显示金纳米颗粒定位于CoREST复合物上。但该探针未在显示CoREST复合物侧视图的分类中出现，限制了在CoREST复合物内对HDAC催化结构域明确鉴定与定位。

论文解读：用于I类HDAC共抑制物复合物冷冻电镜可视化的HDAC抑制剂–纳米金探针的合成

一、研究背景与意义

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）可催化N-乙酰化赖氨酸残基上乙酰基的水解，亦能作用于非组蛋白底物。人类HDACs分为四类：I类（HDAC1–3及HDAC8）、IIa类（HDAC4、5、7、9）、IIb类（HDAC6、10）、IV类（HDAC11），以及NAD⁺依赖的III类（Sirtuins，SIRT1–7）。其中I类HDAC1、HDAC2、HDAC3在体内以多功能蛋白共抑制物复合物形式存在——HDAC1/2可逆换存在于CoREST、MiDAC、SIN3、NuRD、MIER及RERE复合物中，HDAC3则存在于SMRT/NCoR复合物中，各伴侣蛋白决定核小体底物特异性并赋予不同细胞功能。

冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）单颗粒技术已成功解析MiDAC及SIN3等I类HDAC复合物高分辨结构，但含HDAC1/2、CoREST及赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）的三元CoREST复合物因固有柔性限制重构分辨率，难以确定HDAC催化结构域相对LSD1的空间取向。明确HDAC活性位点空间位置对理解CoREST结合核小体底物的机制至关重要。纳米金颗粒（nanogold particles，直径1–5 nm）电子密度高、在显微成像中反差强，已被用于免疫金电镜及细胞冷冻电子断层扫描。本研究由英国莱斯特大学研究所结构化学与生物学Wiktoria A Pytel、John W R Schwabe及James T Hodgkinson开展，旨在合成纳米金偶联I类HDAC抑制剂并评估其在单颗粒cryo-EM中定位CoREST复合物内HDAC活性位点的适用性，论文发表于《Beilstein Journal of Organic Chemistry》。

二、主要关键技术方法

研究人员以I类HDAC抑制剂CI-994为母体，在其乙酰胺外侧位置引入9碳烷基连接臂以减小位阻，经HATU介导酰胺缩合、脱苄基保护、活化NHS酯后，与商品化单氨基1.4 nm纳米金颗粒（Monoamino-Nanogold^?，Au–NH₂）室温偶联，过量小分子配体经离心洗涤去除，产物浓度用420 nm紫外吸收按Beer–Lambert定律计算。采用HEK293F细胞表达并纯化FLAG标签CoREST三元复合物（HDAC1–LSD1–CoREST），以Boc-Lys-(Ac)-AMC荧光脱乙酰酶试剂盒检测游离探针及对照对复合物HDAC活性的抑制，测定IC₅₀值。将戊二醛交联的三元复合物与Au–(CI-994)探针按2:1摩尔比孵育，在Titan Krios显微镜上采集数据，TOPAZ自动抓粒后经多轮2D分类分析探针定位情况。

三、研究结果

Design and synthesis of a HDAC inhibitor–nanogold probe（HDAC抑制剂–纳米金探针的设计与合成）

研究人员依据CI-994类似物与HDAC2共晶结构（PDB: 4LY1），确认乙酰胺部分朝活性口袋外，故在此引入C9烷基连接臂并偶联1.4 nm胺基功能化纳米金簇（Au₁₁核，配三芳基膦配体，一直径≈1.4 nm），最终获得Au–(CI-994)探针，产物质控经¹H NMR及负染电镜确认粒径均一、无聚集。

The HDAC inhibitor–nanogold probe inhibits HDAC enzymatic activity in the CoREST complex（HDAC抑制剂–纳米金探针抑制CoREST复合物内HDAC酶活性）

荧光脱乙酰酶活性检测显示，空白纳米金（Au–NH₂）自身对CoREST复合物HDAC活性约有50%抑制（推测源于金表面与溶剂可及半胱氨酸巯基作用），而Au–(CI-994)在0.54 μM近完全抑制HDAC活性，测得IC₅₀＝0.19±0.08 μM，与母体CI-994（IC₅₀＝0.53 μM）相当，表明纳米金偶联未显著削弱抑制剂对HDAC活性中心的竞争性结合与抑制能力。

The HDAC inhibitor–nanogold probe localizes with the CoREST complex in cryo-EM（HDAC抑制剂–纳米金探针在cryo-EM中与CoREST复合物共定位）

经戊二醛交联并与探针孵育的样品在cryo-EM下收集1965张显微照片，自动拾取370670个颗粒，2D分类后得到具双叶构象的CoREST复合物典型投影；部分俯视类中可见纳米金特征性强反差"黑点"与复合物共现，证实探针结合于复合物。但在显示侧视投影的2D分类中未见金颗粒信号，无法据此唯一判定HDAC催化结构域相对LSD1的具体方位。

四、讨论与结论总结（翻译结论部分）

综上所述，研究人员报道了Au–(CI-994)——一种用于I类HDAC共抑制物复合物cryo-EM可视化的纳米金偶联HDAC抑制剂——的合成与验证。Au–(CI-994)可有效抑制CoREST复合物内HDAC活性，效价与CI-994相当。该探针在cryo-EM下清晰显现于CoREST复合物关联区域；然而，因其在侧视2D分类中缺如，未能精确锚定HDAC催化结构域位置。研究人员推测C9烷基连接臂及纳米金额外柔性可能导致信号平均掩盖确切位点，且复合物未被探针完全饱和也可能是原因之一。后续工作拟刚性化连接臂并提升HDAC结合亲和力。尽管如此，纳米金标记HDAC抑制剂有望作为cryo-EM中的基准标志物（fiducial markers），辅助大尺度柔性多蛋白复合物中特定亚基或结合位点的定位。