《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：Proteomic analysis reveals distinct gene regulatory functions of the paralogs MAGOH and MAGOHB in cell proliferation
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MAGOH和MAGOHB作为剪接外显子复合体（EJC）的核心组分，虽在基础功能（如剪接保真性和NMD）上呈现冗余，但通过单敲除细胞模型和蛋白质组学发现其非冗余作用：MAGOH缺失影响线粒体ADP/ATP载体SLC25A4代谢，MAGOHB缺失则抑制PI3K-Akt信号通路，共同维持细胞增殖和代谢平衡。
作者：Ayushi Rehman、Raja Tamilselvan、Priyanka Yadav、Sourabh Chakrabarty、Pitter F. Huesgen、Kusum Kumari Singh
印度古瓦哈提印度理工学院生物科学与生物工程系RNA结合蛋白实验室，古瓦哈提，781039，印度
摘要
MAGOH和MAGOHB这两个基因是外显子连接复合体（Exon Junction Complex, EJC）的核心组成部分。先前的研究表明，同时缺乏这两个基因会导致细胞死亡，这突显了它们的关键作用。然而，它们的潜在冗余性和各自的具体功能仍不明确。为了研究它们的具体功能，我们生成了MAGOH或MAGOHB敲除细胞系。实验结果表明，单独缺乏任何一个基因都足以维持EJC的核心功能，但它们的冗余性并不体现在细胞增殖上，因为单独敲除MAGOH或MAGOHB的细胞表现出明显的生长缺陷。蛋白质组学分析显示，这两种基因在功能上存在差异：MAGOH的缺失会下调线粒体ADP/ATP载体SLC25A4的表达，而MAGOHB的缺失则会特异性地干扰PI3K-Akt信号通路。这项研究揭示了一个关键的非冗余性特征，即MAGOH和MAGOHB共同维持EJC的核心功能，但在调节线粒体代谢和细胞增殖信号通路方面各自承担特定的角色。
引言
同源基因通常由于基因复制而产生，它们之间往往具有高度的序列保守性，可以相互提供功能上的缓冲作用[1]、[2]、[3]、[4]。这种相互依赖性在癌症中尤为明显，其中一个基因的缺失可以被另一个基因所补偿，这给旨在寻找治疗靶点的合成致死筛选带来了挑战[5]。典型的缓冲基因对包括SMARCA2-SMARCA4和ARID1A-ARID1B[6]、[7]。这种缓冲效应形成了一个强大的遗传网络，保护了细胞的基本过程免受单一基因突变的有害影响。然而，这种缓冲作用也可能掩盖了每个基因可能具有的独特、非冗余的功能。缓冲作用的程度受到蛋白质-蛋白质相互作用伙伴数量的影响，连接紧密的同源基因通常表现出较少的冗余性和更严重的功能丧失[8]。因此，在功能遗传学中一个关键问题是确定在何种细胞环境下这种缓冲作用会失效，从而揭示它们各自的具体功能。
一个适合研究的同源基因对是MAGOH和MAGOHB，它们具有几乎相同的序列，并作为外显子连接复合体（EJC）的核心组成部分[9]、[10]、[11]。EJC作用于剪接后的mRNA，在RNA加工的多个步骤中起着关键作用，其组成部分如eIF4A3和RBM8A（Y14）的突变会导致严重的神经发育障碍，如Richiera-Costa综合征和TAR综合征[12]、[13]。这表明EJC的重要性，以及其核心成分对正常发育的不可或缺性。最近的研究表明，MAGOH和MAGOHB在多种癌症中过度表达[14]、[15]、[16]、[17]、[18]，但由于它们之间的高度依赖性[19]，很难区分它们的独特生物学功能。在小鼠中，MAGOH的缺失会导致小头症[20]、[21]，但每个基因的具体贡献仍不清楚。这两个基因在各种组织中的持续表达表明它们执行基本的细胞功能；然而，它们在生物体或细胞层面上的功能特异性仍有很大的探索空间。
在这项研究中，我们系统地探讨了MAGOH同源基因在HEK-293细胞中的功能冗余性和特异性。我们发现，虽然MAGOH和MAGOH在EJC的核心功能（如剪接和无义RNA的降解）上具有冗余性，但在调节细胞增殖、线粒体代谢和PI3K-Akt信号通路方面则具有不同的、非冗余的功能。
部分内容摘录
crRNA的设计与克隆
我们采用双重引导RNA策略来切除MAGOH和MAGOH基因组中外显子1周围的区域[22]、[23]。crRNA的设计使用了Alt-R Cas9（IDT）、Breaking-Cas[24]和CHOP-CHOP[25]等工具，以确保它们不会与其他同源基因发生直接结合。使用IDT提供的CRISPR-Cas9 Checker工具分析了脱靶结合位点。相应的crRNA靶点被设计成DNA寡核苷酸，然后克隆到en1FnCas9质粒的BbSI位点中，如之前所述
MAGOH和MAGOHB在EJC相关功能上具有冗余性
MAGOH同源基因在不同物种中都存在保守性。Singh等人在2013年的研究表明，这两种基因在多种小鼠组织中持续表达[28]。在本研究中，我们使用GTEx数据库分析了MAGOH和MAGOH在人类组织中的表达模式（图1A–B）。与小鼠数据一致，发现这两种基因在人类组织中也持续表达。有趣的是
讨论
本研究系统地分析了两种高度同源的EJC核心成分MAGOH和MAGOH之间的功能关系。虽然我们证实了它们在NMD（核苷酸甲基化）和剪接保真度等基本EJC活动中的冗余性，但研究结果揭示了在细胞增殖、蛋白质组调控和特定信号通路层面存在关键的非冗余性。单个基因敲除细胞的存活能力以及EJC核心功能的保持情况表明
CRediT作者贡献声明
Ayushi Rehman：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据分析、数据整理。Raja Tamilselvan：撰写 – 审稿与编辑、软件开发、方法学设计、实验设计、数据整理。Priyanka Yadav：方法学设计。Sourabh Chakrabarty：方法学设计。Pitter F. Huesgen：撰写 – 审稿与编辑、实验指导、软件开发、资源获取、资金申请。Kusum Kumari Singh：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写
资金支持
KKS感谢ICMR项目（项目编号ICMR/2020-0476/CMB）和DBT项目（项目编号BT/PR27877）的资助。AR和SC由印度政府人力资源与发展部提供的奖学金支持。PY由印度政府总理研究奖学金（PMRF）资助。PFH得到了德国研究基金会（DFG，项目编号517812866和GRK2606 - 423813989）的支持。
致谢
作者感谢科隆大学的Niels Gehring教授提供MAGOH质粒，并就项目进行了多轮讨论。同时感谢古瓦哈提印度理工学院的Anil Mukund Limaye博士在研究中的宝贵建议。我们还要感谢Friedel Drepper和Henrique Baeta在蛋白质组数据分析方面提供的帮助。此外，也感谢Debojyoti Chakraborty教授在基因组学与整合生物学研究所的支持
