深度学习赋能PfCSP表位空间阵列支架的构建

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Deep learning–enabled scaffolding of spatial arrays of PfCSP epitopes

为开发可诱导高效保护性抗体L9的新型疟疾疫苗，研究人员利用生成式深度学习模型设计了包含多个NPNV表位的支架蛋白。结果显示，构建的单/多表位支架可准确呈现靶表位的结合构象与相对空间取向，并在小鼠模型中展现出一定的肝脏侵袭抑制能力。该工作展示了深度学习在复杂多表位疫苗设计中的巨大潜力，是向开发新一代高效疟疾疫苗迈出的重要一步。

　　

疟疾，这个由疟原虫引起的古老疾病，至今仍在全球，特别是发展中国家，造成严重的疾病负担。尽管以疟原虫环子孢子蛋白(CSP)为主要靶点的RTS,S/AS01等疫苗已获许可，但其保护效力仅为部分，且会随时间衰减。科学家们一直在探索如何设计出更高效的下一代疫苗。其中，一种名为L9的单克隆抗体(mAb)成为了希望的灯塔——它在临床前模型和人体试验中都显示出极强的保护效力。L9通过特异性地、多价地结合CSP蛋白连接区内的NPNV基序发挥功能。冷冻电镜(cryoEM)研究揭示，三个L9抗体的抗原结合片段(Fab)会以一种“螺旋”状的四级结构与一个CSP分子结合，每个Fab结合一个NPNV基序，并且相邻Fab之间还存在同型相互作用。这些Fab间的接触被认为与L9强效的保护作用相关。这引发了一个激动人心的设想：能否设计出一种免疫原，精确地呈现多个NPNV表位在L9结合时的构象和空间相对位置，从而诱导产生类似L9的保护性抗体？

这正是本篇发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》上的研究所要回答的核心问题。研究人员利用最前沿的生成式深度学习人工智能(AI)模型，迈出了设计此类多表位支架免疫原的关键一步，旨在为开发高效疟疾疫苗开辟新路径。

为开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：1. 生成式深度学习模型设计，包括RoseTTAFold（用于单表位支架）和RFdiffusion（用于多表位支架）来生成蛋白质骨架，并结合ProteinMPNN进行序列设计。2. 酵母表面展示技术，用于从大规模设计库中高通量筛选具有高亲和力、正确折叠的支架变体。3. 多种生物物理与结构表征技术，包括表面等离子共振(SPR)、动力学排除实验(KinExA)测定亲和力；圆二色谱(CD)、差示扫描量热法(DSC)分析蛋白质稳定性和二级结构；X射线晶体学（用于单表位支架复合物）和冷冻电镜(cryoEM)（用于三表位支架复合物）解析高分辨率三维结构。4. 小鼠疟疾肝脏侵袭模型，用于评估支架免疫原（展示于纳米颗粒上）接种后诱导的抗体反应及其对疟原虫孢子体入侵肝脏的抑制效果。

研究结果

Scaffolding NPNV Epitopes in Bound Conformation. (支架呈现NPNV表位的结合构象)

研究人员首先测试了利用RoseTTAFold设计单表位支架(SES)的能力。他们设计了在L9结合构象中容纳一个NPNV表位（侧翼各加一个残基，序列为ANPNVD）的支架。经过酵母展示筛选和表面亲水性重新设计，获得了SES-1和SES-2两个支架。生物物理表征显示它们具有可溶性和热稳定性。表面等离子共振(SPR)测定表明，SES-1和SES-2与L9 Fab的结合解离常数(K_D)分别为78 nM和29 nM，相比L9与柔性单NPNV肽的结合亲和力（K_D1,900 nM）提高了24至65倍。X射线晶体学解析的SES-2与L9 Fab复合物结构显示，支架化的NPNV表位与天然表位结构高度相似（全原子RMSD=1.34 ?），验证了深度学习能够成功设计出呈现L9结合构象的单NPNV表位支架。

Scaffolding Multiple NPNV Epitopes with Native Orientation. (支架呈现具有天然取向的多个NPNV表位)

接下来，研究团队挑战更复杂的任务：利用RFdiffusion设计能够呈现两个或三个NPNV表位、并保持其天然相对空间取向（模仿L9与CSP复合物中的构型）的支架。他们生成了大量双表位支架(DES)和三表位支架(TES)的设计，并通过酵母展示进行筛选。最终获得了四个DES（DES-1至DES-4）和两个TES（TES-1和TES-2）。值得注意的是，所有成功的TES设计都来自将第三个表位置于线性序列首位的“顺序-3”策略。亲和力测定(KinExA)显示，三个DES的亲和力（K_D151 pM 至 694 pM）比双NPNV肽（K_D4.56 nM）高出6.6至30倍。而TES-1与三NPNV肽的亲和力相近（K_D85 pM vs. 59 pM），但仍比双NPNV肽亲和力高54倍。

Structurally Accurate Design of Multi-NPNV Scaffolds. (多NPNV支架的结构精准设计)

为了检验设计的准确性，研究人员通过冷冻电镜(cryoEM)解析了TES-1与三个L9 Fab复合物的结构。结构显示，所有三个NPNV基序均被L9 Fab结合，并且三个L9 Fab之间形成了与天然CSP肽-L9复合物中相似的同型相互作用（Fab1:Fab2和Fab2:Fab3接触）。每个支架化的NPNV表位与模板结构中的对应表位都对齐良好（全原子RMSD 0.61-0.99 ?）。其中，NPNV 1和NPNV 2的构象和相对位置与设计意图高度一致，而NPNV 3虽然构象正确，但其相对位置发生了偏移（C_αRMSD距离6.3 ?），这可能是由于它位于一个更长、更灵活的环上所导致。尽管如此，该结构依然惊人地证明，深度学习方法能够成功支架化至少两个无序重复表位，并使其以预定的相对取向呈现，同时准确再现了天然L9抗体间的相互作用。

Epitope Scaffolds Elicit Variable Levels of Inhibition in a Mouse Liver Invasion Model. (表位支架在小鼠肝脏侵袭模型中引发不同程度的抑制效果)

最后，研究团队评估了这些支架作为免疫原的潜力。他们将筛选出的高亲和力支架（SES-2, DES-1, TES-1）展示在纳米颗粒上，并免疫小鼠。结果显示，所有支架纳米颗粒均能诱导针对CSP连接区肽段（J3）的特异性抗体反应，而对主要重复区肽段（NANPx6）的反应很弱，这与L9抗体的结合特征一致。在疟疾孢子体肝脏侵袭挑战实验中，所有支架免疫原均能提供相较于佐剂对照组显著的肝脏侵袭抑制。然而，支架免疫原提供的抑制水平低于展示更长天然连接区肽段（J2, J3）的纳米颗粒或全长CSP单体对照。增加支架上呈现的NPNV表位数量（从单表位到三表位）并未显著提高J3特异性抗体滴度或肝脏侵袭抑制效果。这表明，支架化这些天然无序的肽段虽然能提供可测量的保护，但效果有限，可能因为天然肽段免疫原含有更多潜在的表位和构象，能诱导出更高滴度的抗体。

结论与讨论

本研究成功地利用生成式深度学习模型，设计了能够呈现恶性疟原虫CSP蛋白中NPNV保护性表位、并稳定其抗体结合构象的支架蛋白。这是该领域的一项重要进展，首次实现了在单个支架蛋白上精确呈现多个线性表位在预定空间相对位置的目标。结构生物学证据，特别是三表位支架TES-1与L9抗体复合物的冷冻电镜结构，强有力地证实了设计的成功：两个表位（NPNV 1和2）的构象和相对取向与天然状态高度一致，并且成功再现了L9抗体间的关键同型相互作用。

尽管第三个表位的位置有所偏移，且支架免疫原在小鼠模型中诱导的保护效力目前仍有限，但这项工作在概念上取得了重要突破。它展示了人工智能驱动设计在创造复杂多表位疫苗免疫原方面的巨大潜力。研究人员在讨论中也指出了未来的优化方向，例如改进第三个表位的空间定位、通过减小支架尺寸或糖基化掩蔽来增强免疫聚焦、优化纳米颗粒展示策略，以及借鉴HIV广谱中和抗体的种系靶向策略，引入突变以有效激活L9前体B细胞。

总之，这项研究不仅为开发旨在诱导L9样抗体的新一代疟疾疫苗迈出了关键的第一步，其建立的方法学框架——即利用深度学习设计具有预定空间排列的功能位点阵列——也将为疫苗、疗法乃至酶的设计等更广泛的生物应用领域打开新的大门。随着深度学习方法的不断进步，此类设计的成功率和应用范围必将得到进一步拓展。