金藻（Aurelia aurita）幼体的冷冻保存：一种用于研究高水分含量海洋物种低温生物学的新模型

《Cryobiology》：Cryopreservation of Aurelia aurita larvae, a new model for understanding cryobiology in high-water content marine species

　　摘要
海洋物种的冷冻保存是生物多样性保护、种群管理以及水产养殖和生物研究发展的重要工具。目前，在多种海洋无脊椎动物的配子、胚胎、幼虫甚至幼体的冷冻保存方面已经取得了显著进展。然而，刺胞动物，尤其是水母，仍然在很大程度上未被充分研究。在这项研究中，我们报告了首次成功冷冻保存Aurelia aurita的ephyrae（该水母物种的第一个幼虫阶段）的案例。这种水母的特点是含有极高的水分（96.3%），这给冷冻保存方法带来了独特的挑战。在本研究中，我们使用了不同浓度的二甲基亚砜（Me2SO，范围从0.5到6 M）进行了毒性测试。同时，我们设计了两种冷冻保护剂混合物，并评估了它们的冷冻保存效果。第一种混合物由1 M Me2SO和0.5 M二甲亚酰胺（DMF）组成；第二种混合物则包含1.5 M Me2SO、0.04 M海藻糖（TRE）以及1% BSA作为解冻后的补充剂。第一种混合物在解冻后立即实现了100%的存活率，而在48小时后存活率为33%；第二种混合物在两个时间点上都保持了33%的存活率。通过活/死荧光染料评估了幼虫的损伤情况和存活能力，从而确认了存活个体的完整性。这些结果标志着首次成功冷冻保存水母幼虫的案例，为凝胶状浮游动物的离体保护工作带来了重要进展。这项工作为进一步研究海洋物种的冷冻保存方法奠定了基础，有助于更好地理解高水分含量生物体的生理特性，并为海洋生物多样性和刺胞动物模型系统的研究开辟了新的可能性。

1. 引言
本研究旨在探讨全球分布的水母Aurelia aurita（Linnaeus, 1758）的ephyrae阶段的冷冻保存方法。该物种具有复杂的生活周期：水螅型刺胞动物的生活周期在固着无性繁殖的多息肉阶段和浮游水母阶段之间交替进行（图1A–B）。从固着阶段开始，多息肉会经历一种称为“strobilation”的过程（无性繁殖）（图1B–D），在此过程中多息肉会进行横向分裂并释放出称为ephyrae的小型水母[28]（图1B和C）。这些幼虫会经历一系列变态过程，最终长成直径可达5-40厘米的水母。Aurelia aurita是雌雄异体的生物，通过外部产卵进行有性繁殖；受精卵发育成浮浪幼虫，随后沉降并变态为多息肉，从而完成生命周期（图1C）。

2. 材料与方法
2.1. 水母培养与繁殖
Aurelia aurita的幼虫来源于两个途径：一是当地的水族公司（JellyFarmer S.L.），其中多息肉通过使用吲哚美辛（Indomethacin）进行了化学刺激；二是维戈大学ECIMAT海洋站（CIM-Universidade de Vigo）自然产卵事件中获得的幼虫。多息肉被培养在培养皿中。幼虫则被饲养在装有过滤海水（FSW，1 μm + UV）的特殊圆形水族箱中，并保持恒定的空气流动。多息肉和幼虫都以Brachionus plicatilis Müller（1786）为食物，每天每毫升培养液喂食1个浮游动物。

2.2. 二甲基亚砜（Me2SO）的毒性初步研究及平衡时间测定
2.2.1. 对Me2SO的敏感性
通过评估Aurelia aurita ephyrae在暴露于低浓度Me2SO（0.5 M和1 M）后的存活率和形态变化来确定其敏感性。共进行了三种处理：对照组仅使用过滤并经过紫外线消毒的海水（FSW）；另外两种处理分别使用0.5 M和1 M浓度的Me2SO。每种处理重复三次，每次三个ephyrae，共计27个ephyrae。将所有ephyrae放入含有2.5 mL海水的35 × 10 mm培养皿中。随后向每个培养皿中加入2.5 mL的冷冻保护剂溶液（浓度为最终所需浓度的两倍）。对照组则加入2.5 mL FSW。每种处理重复三次（n = 3）。ephyrae一次性暴露于冷冻保护剂中并平衡5分钟。之后，使用巴斯德吸管将ephyrae转移至含有80 mL过滤海水（FSW）的容器中，置于20°C下培养48小时，并每天喂食。48小时后，评估幼虫的存活率和正常形态比例。根据这些数据确定了Me2SO的无效应浓度（NOEC）和有效应浓度（LOEC）。这些浓度被用于新冷冻保存方案的设计。

2.2.2. 游泳脉冲频率的测定
游泳脉冲频率被用作衡量不同浓度Me2SO影响的指标。游泳动作包括两个阶段：动力阶段和恢复阶段。在动力阶段，环形肌肉收缩使水母伞部直径减小，排出伞部与触手之间的液体；随后环形肌肉放松，进入恢复阶段，伞部直径恢复，重新充满液体。与具有连续伞缘的成年水母不同，ephyrae的触手呈不连续状，但通过对称移动的触手之间形成的粘性边界层实现有效的推进和捕食。随着幼虫发育，这种粘性层逐渐分化为更明确的物理结构，并在触手之间扩展[1,18]。这种模式生物的一个显著特征是其极高的水分含量——其身体95.56 ± 0.57%为水分[34]；剩余的3.8%固体物质中包含3.2%的盐分和0.6%的干蛋白。水母介于原始生物和复杂生物之间，其独特的特征（如古老的进化历史、强大的再生能力以及分散的神经系统）使其在进化生物学、神经科学、衰老研究、生物技术和环境科学领域具有重要价值。

2.3. 冷冻保存方法
无论是受威胁的还是未受威胁的海洋物种，冷冻保存都是生物多样性保护的一种可行方法。它不仅有助于保护遗传多样性和管理具有恢复力的种群，还能补充过度开发的自然种群。此外，这项技术在水产养殖中也有直接应用，可以提供具有遗传价值的品种或持续的幼虫/幼体供应，从而解决季节性繁殖问题并减轻对野生种群的压力。冷冻保存模型海洋生物还有助于提高研究效率、优化空间利用，并便于研究人员进行培养和研究[5,22,27,39,44]。

2.4. 海洋生态系统中的无脊椎动物
在海洋生态系统中，无脊椎动物在食物网和生态系统服务中发挥着核心作用，同时对全球生物多样性做出重要贡献。它们的功能包括过滤水、处理有机物、通过食物链传递碳、循环营养物质以及形成栖息地。目前，已有成功的冷冻保存方案适用于多种海洋无脊椎动物的精子、胚胎、幼虫阶段，甚至幼体[31,42]，包括环节动物[6,38]、多种海胆[3,8,13,30,43,50]以及软体动物如贻贝[22,46]、牡蛎[4,49]和蛤蜊[22]。其中，特别关注的是在西班牙（尤其是加利西亚地区）具有商业价值的物种，例如Paracentrotus lividus海胆[30,41]和Mytilus galloprovincialis贻贝[23,24,31]的精子、胚胎和幼体冷冻保存方案。

2.5. 刺胞动物的冷冻保存
刺胞动物在冷冻保存领域是研究最少的门类之一。现有的冷冻保存方案主要集中在珊瑚[12,20]、海葵[16]和珊瑚虫[52]上，目前尚无专门针对水母的冷冻保存方案。对于内部水分含量超过90%的生物来说，冷冻保存面临重大挑战，因为细胞内冰晶形成的风险极高。此外，这些幼体具有复杂的组织和器官结构，进一步增加了制定有效冷冻方案难度。这一领域在冷冻生物学中几乎未被探索，且具有独特的生物学特性。

2.6. 研究目的
本研究旨在提出首个水母幼虫的冷冻保存方案，并将该生物作为冷冻生物学的模型，为新的研究方向、创新技术的发展以及发现具有潜在应用价值的独特特征提供机会，不仅限于海洋冷冻生物学，也推动整个冷冻生物学领域的发展。在化学脱节的情况下，没有测量0.5 M和1 M浓度下的脉动率。共测试了七种处理方法，每种方法有三个重复实验。每个重复实验包含三个幼体，因此每种处理方法共有九个幼体。所有重复实验中的三个幼体都被放置在一个35 × 10毫米的培养皿中，培养皿内含有2.5毫升的海水（总样本数n = 54）。然后，在15分钟的暴露时间内，向每个培养皿中一次性加入2.5毫升的冷冻保护剂溶液（其浓度是最终所需浓度的两倍）。对于对照组处理，加入了2.5毫升的FSW（过滤海水）。每种处理方法都进行了三次重复实验（n = 3）。这段时间之后，幼体被转移到装有80毫升FSW的100毫升容器中，并进行轻微充气处理，然后在20°C下孵育48小时，期间每天喂食。在暴露后48小时，评估了幼体的大小和正常形态的百分比。

2.4 使用冷冻保护剂混合物进行冷冻保存
测试了两种冷冻保护剂混合物：(i) 1 M Me2SO与0.5 M二甲亚砜（DMF）的组合；(ii) 1.5 M Me2SO加上0.04 M海藻糖（TRE）和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的组合。使用Me2SO作为冷冻保护剂在多种海洋物种的冷冻保存中已经得到了广泛应用[39]，无论是单独使用[25,26,32]还是与TRE结合使用[12,21,30,41]，因此它是开发这一实验方案的一个良好起点。BSA作为解冻后的处理方法已被证明是有效的，可以提高重新附着率并减轻氧化应激[45,53]。BSA（0.1%）仅在将幼体转移到过滤海水（FSW）之前作为解冻后处理使用。其目的是减轻与冻融过程相关的氧化应激[45,53]并减少静态相互作用，从而支持结构和功能的恢复[12,40]。由于据报道Me2SO具有中和毒性的作用[14]，也测试了DMF，因为在海洋细胞中也观察到了类似的保护效果[7]。

2.5 冷冻保存方案、解冻和解冻后孵育
测试了两种冷冻保护剂混合物溶液：一种含有1 M Me2SO和0.5 M DMF的组合；另一种含有1.5 M Me2SO和0.4 M海藻糖（TRE）的组合。在后一种情况下，解冻后应用了0.1% BSA处理1分钟。每次冷冻保存实验共使用了24个幼体，并分为三个重复实验（n = 3）。对照组由三个每个包含三个幼体的重复实验组成。剩余的十五个幼体被分配到十个35 × 10毫米的培养皿中，每个培养皿含有2.5毫升的UV过滤海水（FSW）。随后，在室温（20°C ± 1°C）下向每个培养皿中加入2.5毫升的冷冻保护剂溶液15分钟。在平衡期后，幼体被转移到0.5毫升的塑料吸管中。平衡后，吸管被放入已经处于4°C的低温室（Freeze Control System，Cryologic Pty Ltd，Mt Waverley，澳大利亚）中。经过2分钟的保持时间后，温度以1°C/分钟的速度降低到-12°C，并在该温度下保持2分钟，此时进行播种以确保已经发生核化或必要时手动启动核化过程。播种后，温度继续以1°C/分钟的速度降低，直到达到-35°C。在-35°C下保持2分钟后，吸管直接浸入液氮中。吸管通过在35°C的水浴中浸泡6秒进行解冻。然后将幼体转移到装有80毫升FSW的100毫升塑料容器中，并进行通气处理，在20°C ± 1°C的等温室中孵育48小时，期间每天喂食。

由于这项研究的新颖性以及缺乏针对水母或其他刺胞动物的成熟冷冻保存方案，实验设计在48小时的常规孵育时间之前包括了一些探索性步骤，以检查幼体的进展。在T0（解冻后立即）和T1（解冻后24小时）收集了两个单独的子样本（n = 3），使用碘化丙啶（1 mg/mL）和Hoechst 33342（1 μM）进行荧光染色，以探索和评估解冻后孵育过程中幼体的生理状态和结构完整性。这些子样本的收集是为了获得关于细胞和组织反应的关键基线信息。最后，在解冻后48小时（T4），再次抽取三个重复样本（n = 3）与对照组进行比较。

2.6 长期使用冷冻保护剂混合物进行冷冻保存
为了冷冻保存这大批幼体，过程与之前描述的相同。在这个实验中，选择的组合是1.5 M Me2SO加上0.04 M TRE作为冷冻保护剂，以及0.1% BSA。BSA（0.1%）仅在解冻后作为处理使用1分钟，然后将幼体转移到过滤海水（FSW）中进行孵育。三百个幼体被分配到十个35 × 10毫米的培养皿中，每个培养皿含有2.5毫升的UV过滤海水（FSW）和2.5毫升的冷冻保护剂溶液（浓度是目标浓度的两倍），平衡时间为15分钟。在此期间，我们设法将每个0.5毫升的吸管中装载5个幼体。对照组幼体（n = 100）被维持在空气-Kreisel水族箱中，水中含有6500毫升FSW，并进行持续充气（20°C ± 1°C）。冷却和解冻过程如前所述进行，幼体首先被释放到含有0.1% BSA的FSW中，然后转移到每个含有100个幼体的三个空气-Kreisel水族箱中。对照组和处理组的幼体在它们的水族箱中以每天1个轮虫的密度喂食15天。

2.7 生存能力和细胞损伤评估
为了分析细胞损伤和确定存活百分比，采用了活死荧光方法。这种染色使用了碘化丙啶（1 mg/mL；死细胞发出红色荧光）和Hoechst 33342（1 μM；含有活性DNA的活细胞发出蓝色荧光），孵育时间为2分钟（改编自Lema等人，2011 [33]）。使用Olympus CX43荧光显微镜（CL-CX43-RFA-T）检查了幼体的损伤情况，分析了每个样本中的所有幼体。在短期冷冻保存实验中，使用冷冻保护剂混合物的子样本在三个时间点进行了评估：解冻后立即（T0）、解冻后24小时（T1）和解冻后48小时（T2）。相比之下，在长期幼体冷冻保存实验中，只分析了两个子样本：解冻后24小时（T1）和解冻后16小时（T16）。

3. 结果
3.1 Me2SO的毒性测试
暴露于0.5 M和1 M Me2SO没有观察到明显的形态变化，边缘瓣膜的结构完整，没有观察到口盘损伤（图2A–F）。由于缺乏选择这些幼体中CPA（冷冻保护剂）平衡时间的成熟框架，最初选择了5分钟的探索性暴露时间，以允许CPA进入细胞。由于没有观察到明显的不良影响，随后进行了实验以更精确地确定非致死浓度Me2SO的平衡时间。幼体暴露于1 M Me2SO 20分钟后，15分钟后显示出功能受损的最初迹象（脉动减弱和中央盘偶尔翻转），20分钟后收缩最小，但在转移到清洁的海水中后完全恢复。基于这些结果，15分钟被定义为进行更详细的Me2SO毒理学研究和这些初步冷冻保存试验的最佳平衡时间。

3.2 不同脱节来源的Me2SO毒性评估
考虑到有两种非常不同的脱节方法，评估了来自这两种来源的幼体对Me2SO的敏感性。在任何测试的Me2SO浓度下，无论是存活百分比还是每30秒的游动脉冲数，与对照组相比都没有观察到显著差异（图3），除了在2.5–3 M浓度下，与对照组相比游动脉冲数有显著差异（图3B），但这仅适用于通过化学脱节获得的幼体。

3.3 使用冷冻保护剂混合物进行冷冻保存
首次成功实现了水母幼体的冷冻保存，特别是Aurelia aurita的幼体，解冻后的存活率为100%，48小时后的存活率为22.2%（图5）。解冻后，所有幼体都存活；然而，在表皮和边缘瓣膜上观察到了可见的损伤（图6A–B），并且这些生物没有表现出游动活动。

3.4 使用冷冻保护剂混合物进行冷冻保存
首先使用1.5 M Me2SO加上0.04 M TRE作为冷冻保护剂，然后使用0.1% BSA作为解冻后处理。在解冻后，存活率为约33%（T0），并在解冻后48小时（T2）保持这一水平。对照组和T2之间的存活率存在显著差异（图7）。

3.5 使用冷冻保护剂混合物进行冷冻保存
3.5.1 使用Me2SO 1 M + DMF 0.5 M进行冷冻保存
首次成功实现了伞形水母幼体的冷冻保存，特别是Aurelia aurita的幼体，解冻后的存活率为100%，48小时后的存活率为22.2%（图5）。解冻后，所有幼体都存活；然而，在表皮和边缘瓣膜上观察到了可见的损伤（图6A–B），并且这些生物没有表现出游动活动。

3.6 使用Me2SO 1.5 M、TRE 0.04 M和BSA 0.1%进行冷冻保存
使用1.5 M Me2SO、0.04 M TRE和0.1% BSA进行冷冻保存后，解冻后的存活率为约33%（T0），并在解冻后48小时（T2）保持这一水平。对照组和T2之间的存活率存在显著差异（图7）。

3.7 细胞损伤和存活能力评估
为了分析细胞损伤和确定存活百分比，采用了活死荧光方法。这种染色使用了碘化丙啶（1 mg/mL；死细胞发出红色荧光）和Hoechst 33342（1 μM；含有活性DNA的活细胞发出蓝色荧光），孵育时间为2分钟（改编自Lema等人，2011 [33]）。使用Olympus CX43荧光显微镜（CL-CX43-RFA-T）检查了幼体的损伤情况，分析了每个样本中包含的所有幼体。

在短期实验中，使用冷冻保护剂混合物的子样本在三个时间点进行了评估：解冻后立即（T0）、解冻后24小时（T1）和解冻后48小时（T2）。相比之下，在长期幼体冷冻保存实验中，只分析了两个子样本：解冻后24小时（T1）和解冻后16小时（T16）。在16个发育阶段时，观察结果有显著差异。未检测到触手聚集现象，而且ephyrae（水母的幼体阶段）表现出正常的形态（图9C-F），边缘瓣的尖端已经完全恢复（图9E-F）。尽管所有存活的ephyrae都显示出正常的形态，但它们的发育状态仍存在轻微差异（图9G-I）。此外，所有存活的ephyrae都具有正常的捕食和游泳能力。

图9. A. aurita ephyrae在两个时间点的图像：A-C（T0 = 1个发育阶段）和D-I（T1 = 16个发育阶段）。荧光图像（A-F）用碘化丙啶（红色，死细胞）和Hoechst 33342（蓝色，活性DNA）染色。A和B（A, B）是冷冻保存后脱落的触手残余物和边缘瓣。1个发育阶段的冷冻保存ephyrae具有球形形态且没有细胞损伤（C）。(D–F) 16个发育阶段的冷冻保存ephyrae：(D) 手柄和口部，(E) 表皮，(F) 边缘瓣和触手。粗箭头表示触手；细箭头表示手柄。尺寸刻度分别为A, C, D, E和F（500 μm），B（200 μm）以及G-I（1 mm）。荧光图像使用Adobe Photoshop（Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA）进行了最小程度的亮度和对比度调整以便于观察。

结果表明，在培养的16天内，冷冻保存的ephyrae经历了生长（图10）。在第15天，对照组中可以观察到幼体大小的减小，这可能是实验设计的一个误差。幼体的生长与观察到的发育情况一致（图10）。

最终，生存率分析显示，在1个发育阶段的亚样本中，生存率为88%（图11A）。然而，这一比例随时间下降，在16个发育阶段时降至2.6%，相对于冷冻保存前的生存率。如果我们排除实验过程中发生的13%的损失（这并非冷冻保存的结果），那么相对于成功度过冷冻保存过程的ephyrae，生存率增加到3.065%（图11 A-B）。

细胞的含水量是制定冷冻保存方案的重要参数之一。我们选择的模型生物的含水量非常高，其体积的90%以上是海水[34]。研究结果提供了首个证据，证明即使含有高水分，水母幼体也可以被冷冻保存。考虑到它们易于培养、维护要求低、透明度高以及能够经受冷冻保存，这些生物似乎是非常适合用于高含水量生物冷冻研究的良好模型。

作为我们实验室的新模型，我们进行了一些技术调整和实验设计上的改进，以确定有用的终点并获得良好的重复性。下面将详细讨论所有这些知识以及获得的结果所基于的一些假设。

首先研究的冷冻保护剂是Me2SO。由于缺乏关于其毒性和对水及Me2SO渗透性的背景信息，我们进行了一个相当保守的初步毒性测试（低浓度的Me2SO和仅5分钟的暴露时间），以估计对幼体的安全浓度。最初的测试显示，在0.5–1 M Me2SO暴露48小时后，对生存率或形态没有影响。这一初步实验促使我们研究了平衡时间的影响。尽管样本量有限（n = 3），但该实验旨在探索由于脱水和毒性可能导致的生理压力迹象，特别是游泳行为和伞部形态的变化。重要的是，从这一点开始，我们的初步平衡时间并不是随意选择的。观察结果显示，在1 M Me2SO暴露15分钟后，功能受损（伞部收缩减少且不规律，伞部翻转）开始显现。然而，当转移到新鲜海水中时，幼体迅速恢复，表明在这一时间窗口内对Me2SO具有良好的耐受性，并且由于收缩-膨胀过程造成的压力较低。因此，这一初步测试为使用15分钟的平衡时间提供了有价值的证据，这是CPA（冷冻保护剂）渗透性和生物体存活性之间的平衡折中。这些信息为进一步优化和使用更大样本量及额外的冷冻保护剂配方提供了基础。因此，对于Aurelia aurita，采用了15分钟的平衡时间作为起点，尽管目前我们还不知道Me2SO进入幼体细胞的速度、在组织中的分布情况，以及15分钟后的实际内部CPA浓度。此外，所选的15分钟暴露时间之前已在海洋冷冻保存方案中成功使用过。

随后进行了Me2SO耐受性的毒性测试，有趣的是，我们发现根据最初用于刺激水螅体的频闪方法不同，幼体在暴露后的脉动活动表现出不同的敏感性，但这些差异仅在较高浓度的Me2SO下显著。这种对Me2SO暴露的增强敏感性可能会影响幼体的存活率，因此需要进一步研究这一现象。本研究中使用的水螅体是通过暴露于Indomethacin（一种非甾体抗炎药）来刺激频闪的。这一现象背后的机制及其影响程度仍有待确定。使用Me2SO + DMF进行冷冻保存后，解冻后的存活率为100%，但表皮和边缘瓣上出现了可见的损伤，并且这些损伤在24小时内逐渐加重（图6A和B），但幼体没有显示出游泳活动。48小时后，存活率降至22%。表皮和边缘瓣的损伤严重到导致这些结构的丧失，ephyrae形态转变为胶状球体，并表现出脉动收缩。48小时后，尽管最初的组织受损导致形态完全丧失，但存活的ephyrae开始恢复，出现了手臂和表皮再生的明显迹象（图6E和F）。使用1.5 M Me2SO + 0.04 M TRE和0.1% BSA进行冷冻保存后，解冻后立即出现致死性，存活率降至33%，并在接下来的48小时内保持这一水平。荧光染色还显示了与中胶层类似的损伤，这与使用1 M Me2SO + 0.5 M DMF立即解冻后的样本相似。24小时后，ephyrae的部分盘状结构完整性丧失，但没有检测到广泛的细胞损伤。手柄保持完整且未受损，它们在48小时内仍保持了一些游泳活动和再生迹象。尽管BSA的抗氧化作用尚不清楚，但其存在有助于改善解冻后的处理和幼体存活。在将ephyrae转移到过滤海水（FSW）之前，使用BSA（0.1%）作为解冻后处理可能有助于减轻氧化应激[45,53]，减少静态相互作用，并支持结构和功能的恢复[12,40]。此外，BSA可能有助于减少再水化和去除冷冻保护剂过程中由于极端折叠造成的组织破裂。通过增加培养基的粘度，BSA可能降低雷诺数，减少对组织的机械应力，并由于其蛋白质特性提供额外的膜稳定性。

水母的高再生能力已有充分记录，甚至对于幼体也是如此[2]。对于这种水母，通过在水中添加某些氨基酸或激素，附肢的再生速度可以加快。这与这两项小规模冷冻保存研究的结果一致，即只要中央盘状结构和手柄结构得到保存，或者损伤为亚致死性，所有受损的边缘瓣都可以再生，包括触手（基本上是一群神经元）。中央盘状结构主要由95–98%的水分、胶原蛋白、fibrillin和称为mesoglein的弹性纤维组成，这些成分由中胶层细胞产生[1]。可能这些中胶层细胞受到了冷冻保存过程的影响，或者在冷冻和解冻过程中蛋白质基纤维发生了变性。与盘状结构相比，边缘瓣是非常薄的结构；在这些结构中，损伤可能是由于冷却和解冻过程中的渗透压应力造成的。

长期实验为我们提供了更多信息。解冻后一天，我们在培养箱中观察到组织聚集现象，收集后发现边缘瓣组织从中央盘状结构上脱落，但触手仍然存活（图9B），这可能表明损伤发生在盘状结构周围的组织层面。解冻后立即由于处理造成的损失仅占幼体的13%。考虑到这一点，第16天的存活率为3.65%。存活的个体已经变态为metaephyras，并具有正常的进食和游泳模式。幼体的生长与对照组相似，但这也高度依赖于温度和食物供应[35,36]。这可以从幼体生长图中看出（图8），其中对照组和处理组都保持相同的每日食物密度/mL，但由于冷冻保存的幼体存活率显著较低，存活的ephyrae的食物供应量高于对照组，对照组在第15天食物就变得稀缺，因此影响了幼体的大小。水母可以在食物供应不足、食物质量低或繁殖期间调节其体细胞生长和退化[19,37]。为了避免这种误差，我们建议自由喂食幼体。另一方面，我们假设长期和短期冷冻保存实验之间存活率的差异可能归因于ephyrae在冷冻保存过程中遭受的损伤程度。正如Abrams等人2015年[1]所报告的，如果损伤影响到手柄，ephyrae将无法进食并在大约两周内死亡。在我们的长期冷冻保存实验中，持续了16天，这段时间足以因手柄损伤而导致进食受损并最终死亡。相比之下，短期实验中的培养时间不足以显示出这种效应。因此，短期内看似亚致死的损伤在较长时间内可能变得致命。

这是首个成功的水母Aurelia aurita冷冻保存方案，证明了使用1.5 M Me2SO加上0.04 M TRE和0.1% BSA作为解冻后处理后，幼体能够实现长期发育并继续生命周期。最后，这项研究为胶状浮游动物的保护开辟了新的途径，推动了刺胞动物生物学的研究，并证明了它是研究高含水量生物在冷冻生物学中的良好模型。

作者贡献声明：
Alba Lago：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，调查，正式分析，数据管理。
Jesus Troncoso：撰写 – 原稿，资源，概念化。
Estefania Paredes：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源，方法学，调查，资金获取，正式分析，概念化。