《PLOS One》：Metformin attenuates TBHP-induced oxidative injury in human lens epithelial cells and is associated with SIRT1/FOXO1-related autophagy
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二甲双胍（MET）作为一线抗糖尿病药物，近年来被越来越多地认为在氧化应激条件下具有细胞保护作用，但其在晶状体上皮细胞（LECs）中的机制仍未被充分阐明。研究人员采用叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的人HLE-B3细胞急性氧化损伤模型，探讨SIRT1/FOXO1相
二甲双胍（MET）作为一线抗糖尿病药物，近年来被越来越多地认为在氧化应激条件下具有细胞保护作用，但其在晶状体上皮细胞（LECs）中的机制仍未被充分阐明。研究人员采用叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的人HLE-B3细胞急性氧化损伤模型，探讨SIRT1/FOXO1相关自噬是否参与MET相关的细胞保护作用。MET预处理可降低细胞内活性氧（ROS）水平，维持抗氧化防御，改善细胞活力，并减少TBHP攻击后的细胞凋亡。MET还增强了自噬标志物；在氯喹（CQ）或bafilomycin A1（BafA1）引起的溶酶体阻断条件下，LC3-II/p62的变化与自噬通量增加相一致。对SIRT1进行药理学抑制（EX-527）或对早期自噬进行药理学抑制（3-methyladenine，3-MA）均可部分削弱MET在氧化应激和细胞生存各项终点上的改善作用，这支持SIRT1/FOXO1相关自噬在该反应中的作用。尽管本研究仅限于体外条件及药理学干预，但这些发现提示，MET可能减轻晶状体上皮的氧化损伤，并凸显SIRT1/FOXO1-自噬作为与白内障发生过程中氧化应激相关的潜在通路。
该文发表于《PLOS One》，围绕年龄相关性白内障（ARC）的关键致病基础展开研究。年龄相关性白内障是全球致盲的首要原因之一，而晶状体上皮细胞（LECs）的氧化损伤被认为是促进晶状体混浊形成的核心环节。活性氧（ROS）过量积聚可突破细胞内源性抗氧化防御，进而诱导蛋白氧化与交联、DNA损伤以及细胞凋亡，最终推动白内障发生发展。尽管白内障手术能有效恢复视力，但其可及性仍受手术风险、禁忌证及社会经济因素限制，因此探索可延缓或阻止白内障发生的药物学机制具有重要现实意义。二甲双胍（MET）除降糖外，近年来在抗氧化和细胞保护方面受到广泛关注，既往眼科研究提示其可能通过调节溶酶体/自噬功能减轻晶状体损伤，但在LECs中是否涉及沉默信息调节因子1（SIRT1，NAD
+依赖性去乙酰化酶）/叉头框蛋白O1（FOXO1，氧化应激响应转录因子）轴仍不明确。基于此，研究人员建立TBHP诱导的急性氧化应激模型，系统评估MET是否通过SIRT1/FOXO1相关自噬发挥细胞保护作用，并分析其对白内障相关氧化损伤过程的潜在意义。
方法上，研究使用商业化人晶状体上皮细胞系HLE-B3建立体外氧化应激模型，以细胞活力检测筛定500 μM TBHP处理4 h为稳定的亚致死损伤条件，并采用0.5 mM MET预处理24 h作为保护方案。主要技术包括CCK-8细胞活力检测、荧光探针法检测ROS、MDA/SOD/MPO/GSH生化指标测定、TUNEL凋亡检测、MDC染色评估自噬泡、免疫荧光与Western blot检测Beclin-1、LC3B、p62、SIRT1、FOXO1及Ac-FOXO1。研究进一步使用3-MA抑制早期自噬、EX-527抑制SIRT1，并在TBHP处理阶段加入CQ或BafA1进行溶酶体阻断，以辅助判断自噬通量变化。
Establishment of oxidative stress model and effects of MET on LEC viability
研究首先构建HLE-B3细胞氧化损伤模型。结果显示，TBHP在4 h处理下呈现清晰的剂量-效应关系，半数抑制浓度约为490 μM；500 μM处理4 h可稳定将细胞存活率降至约50%，适合作为后续机制研究条件。MET单独处理时，0.5–2.0 mM范围内未见明显细胞毒性，而≥2.5 mM则降低细胞活力。进一步保护实验表明，MET预处理能显著提高TBHP损伤后细胞存活率，其中0.5 mM保护作用最明显。该部分说明研究建立了可靠的急性氧化应激体外模型，并确认MET在合适剂量下可提高氧化应激状态下LECs的存活能力。
Effects of MET on oxidative stress markers in LECs
在氧化应激指标方面，TBHP显著升高细胞内ROS荧光信号，提示氧化负荷明显增加；MET预处理则显著抑制这一变化。生化结果与之相一致：TBHP促进丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）和髓过氧化物酶（MPO）活性升高，同时使超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量下降。MET预处理后，MDA和MPO下降，SOD活性恢复，但GSH在本实验条件下未见显著恢复。上述结果表明，MET能够明显减轻TBHP诱导的氧化损伤负荷，但其对不同抗氧化系统组分的调节存在一定选择性。
Effects of MET on apoptosis of LECs under oxidative stress
TUNEL检测显示，TBHP显著增加TUNEL阳性细胞核比例，提示氧化应激诱导了明显凋亡。MET预处理可显著降低TUNEL阳性率，使凋亡水平向基线回归。这说明MET的细胞保护作用不仅体现在抗氧化层面，也体现在抑制氧化应激诱导的细胞凋亡方面。
Effects of MET on autophagy markers in oxidatively stressed LECs
为分析MET是否调节自噬，研究先以MDC染色观察酸性/自噬液泡。TBHP使MDC斑点减少，而MET预处理可恢复或增加斑点数，提示自噬活性可能增强。随后通过免疫荧光和Western blot进一步检测经典自噬标志物。结果显示，TBHP降低Beclin-1和LC3B信号并升高p62，提示自噬受抑；MET则逆转上述趋势，使Beclin-1升高、LC3B增强、p62下降。加入3-MA后，MET诱导的这些变化被部分削弱。Western blot同样显示，TBHP降低Beclin-1和LC3B-II/I比值并升高p62，而MET使Beclin-1和LC3B-II/I升高、p62下降，3-MA可部分逆转该效应。该部分结果支持MET与氧化应激条件下自噬增强相关。
MET enhances autophagic flux under oxidative stress
为区分静态自噬标志物堆积与真正的自噬过程增强，研究引入溶酶体阻断实验评价自噬通量。相较于TBHP组，MET预处理提高LC3B-II并降低p62。加入CQ后，p62积聚且LC3B-II保持较高水平，提示在自噬体持续形成时，溶酶体降解被阻断。短时BafA1处理同样导致p62增加，而LC3B-II未进一步明显升高。研究据此认为，MET相关的LC3B转换增加及溶酶体阻断后p62积聚，整体上符合自噬通量增强的特征。作者同时指出，这一证据仍属于标志物与药理阻断层面的支持性证据，而非单一路径因果性的最终证明。
Involvement of autophagy in the antioxidative effects of MET
为明确自噬在MET抗氧化效应中的贡献，研究在MET处理基础上加入3-MA。结果显示，3-MA可部分逆转MET对ROS升高的抑制作用，同时使MDA和MPO再次升高，提示MET降低氧化负荷的作用部分依赖自噬过程。值得注意的是，GSH仍维持较低水平，说明MET对谷胱甘肽稳态的恢复有限。该部分提示，MET通过促进自噬在降低氧化负担、改善酶性抗氧化防御方面发挥作用。
Involvement of autophagy in the anti-apoptotic effects of MET
在凋亡层面，3-MA同样部分削弱MET的保护作用。与MET单独处理相比，MET+3-MA组TUNEL阳性率升高，表明MET对氧化应激诱导凋亡的抑制至少部分依赖于自噬激活。由此，自噬不仅参与氧化应激缓解，也参与细胞生存维持。
Effects of MET on SIRT1/FOXO1 signaling under oxidative stress
为阐明MET与自噬及细胞保护之间的上游联系，研究检测SIRT1/FOXO1信号。免疫荧光结果显示，TBHP降低SIRT1和FOXO1表达信号，而MET预处理可恢复二者；SIRT1抑制剂EX-527则削弱MET的提升作用。Western blot进一步证实，TBHP降低SIRT1和FOXO1并升高乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1），MET则提高SIRT1和FOXO1表达、降低Ac-FOXO1水平；EX-527能明显消除这些变化。该结果表明，MET在氧化应激条件下可激活SIRT1并促进FOXO1去乙酰化，提示SIRT1/FOXO1应激应答轴被动员。
Involvement of SIRT1/FOXO1 signaling in the protective effects of MET
进一步功能验证显示，EX-527可部分抵消MET的保护作用。与MET组相比，MET+EX-527组ROS升高，MDA和MPO增加，且细胞凋亡加重；但SOD和GSH在MET与MET+EX-527之间差异不显著。这说明MET减轻氧化应激和抑制凋亡的作用至少部分依赖SIRT1/FOXO1通路，尤其体现在ROS清除、脂质过氧化抑制及凋亡缓解方面。
Contribution of SIRT1/FOXO1 signaling to MET-associated autophagy regulation
在自噬层面，EX-527也显著削弱MET的促自噬效应。免疫荧光和Western blot均显示，MET诱导的Beclin-1升高、LC3B增强和p62下降，在EX-527存在时被明显减弱。该结果提示，SIRT1/FOXO1信号参与了MET对LECs自噬调节的过程，支持SIRT1/FOXO1相关自噬是MET发挥细胞保护作用的重要组成部分。
综合讨论部分，研究表明MET预处理能够提高TBHP损伤HLE-B3细胞的存活率，降低氧化负荷并抑制凋亡，同时伴随SIRT1/FOXO1信号激活和符合自噬通量增强特征的分子变化。3-MA与EX-527均只能部分削弱MET效应，说明自噬和SIRT1/FOXO1信号在其中具有重要作用，但现阶段证据主要建立在药理学干预与标志物分析基础上，因此更适合作为支持性、增强假说强度的机制证据。论文还指出，MET在该体系中的抗氧化谱具有选择性：其能降低ROS、MDA和MPO并恢复SOD，却未能显著恢复GSH，提示SIRT1/FOXO1相关自噬可能更偏向于支持酶性抗氧化和蛋白稳态维持，而谷胱甘肽合成或循环可能受其他调控程序支配。此外，研究强调TBHP模型用于模拟稳定而持续的全局性氧化损伤，适合分析急性氧化应激下的细胞保护机制，但其结论仍需在原代LECs及体内白内障模型中进一步验证。
研究结论部分可译为：总之，二甲双胍（MET）预处理可减轻TBHP诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤，在体外降低ROS和脂质过氧化相关指标，并减少细胞凋亡。这些保护作用伴随着对EX-527敏感的SIRT1/FOXO1信号变化，以及在氧化应激条件下与自噬动力学增强一致的自噬标志物/溶酶体阻断模式。总体而言，研究结果支持这样一种模型：SIRT1/FOXO1相关自噬反应可能促进MET在晶状体上皮中的细胞保护作用，这一机制仍有待未来研究进一步验证。
