综述：细胞外囊泡与股骨头坏死：实验与生物信息学证据的整合性回顾

《Journal of Personalized Medicine》：Extracellular Vesicles in Osteonecrosis of the Femoral Head: An Integrated Review of Experimental and Bioinformatic Evidence Elvira Immacolata Parrotta, Giorgia Lucia Benedetto, Giovanni Cuda, Umile Giuseppe Longo, Arianna Carnevale, Olimpio Galasso, Giorgio Gasparini and Michele Mercurio

　　

股骨头坏死（Osteonecrosis of the Femoral Head, ONFH)是一种以骨组织坏死、血管化受损和免疫调节紊乱为特征的进展性疾病，常导致股骨头塌陷。目前能够有效阻止疾病进展的策略十分有限。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs)，包括外泌体（exosomes)和微泡（microvesicles)，介导细胞间通讯，影响骨生成、血管生成和免疫应答。本综述旨在总结EVs在ONFH中的现有证据及其转化应用潜力。研究人员对PubMed、Scopus、Web of Science和Cochrane Central数据库进行了结构化的叙述性文献回顾，纳入了关于EVs在ONFH中的体外、临床前和临床研究。研究人员对EV来源、分子 cargo、信号通路、功能效应和转化应用等数据进行了定性综合。由于提取的数据具有异质性，未进行汇总统计分析。同时，研究人员还总结了基因本体论（Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI)网络等生物信息学分析结果。在体外研究中，来源于骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)、内皮细胞和M2巨噬细胞的EVs可调节成骨分化、血管生成和炎症反应。临床前研究表明，EVs给药可减少股骨头坏死、改善骨小梁结构并促进新生血管形成。临床研究已鉴定出与疾病分期和股骨头塌陷风险相关的EV相关分子：血清淀粉样蛋白A1（Serum Amyloid A1, SAA1)、补体成分4A（Complement Component 4A, C4A)和核糖体蛋白S8（Ribosomal Protein S8, RPS8)。生物信息学分析将EV cargo与调控骨形成、血管化、免疫和代谢的通路联系起来。EVs在ONFH发病机制中发挥关键作用，有望成为诊断和治疗应用的候选靶点。然而，目前的临床证据仍然有限，需要在更大规模的研究中加以验证。尽管如此，EVs的异质性和有限的临床数据仍需标准化的纵向研究来验证其转化相关性。

**引言**

股骨头坏死（ONFH)是一种致残性骨科疾病，以骨组织进行性坏死为特征，可导致关节塌陷、慢性疼痛和严重的功能障碍。其病因具有多因素性，包括糖皮质激素使用、酗酒、创伤性损伤和特发性因素。尽管手术干预和药物治疗取得了一定进展，但能够有效阻止或逆转疾病进展的策略仍然有限，这凸显了深入理解其潜在病理生理机制以及识别新型治疗靶点的必要性。ONFH的进展与局部骨微环境紊乱密切相关，包括成骨受损、血管化缺陷和免疫应答失调。成骨细胞与破骨细胞活动的适当协调，配合充分的血管生成，对于维持骨稳态和防止坏死至关重要。此外，免疫微环境在调节组织修复和炎症方面发挥着关键作用，既可加剧也可缓解疾病进展。细胞外囊泡（EVs)，包括外泌体和微泡，已成为细胞间通讯的关键介质，能够在细胞之间转移蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子。EVs因其调节骨生成、血管生成和免疫应答的能力而日益受到关注，提示其作为骨疾病生物标志物和治疗剂的潜力。近期研究表明，来源于骨髓间充质干细胞（BMSCs)、巨噬细胞和内皮细胞的EVs能够影响股骨头的再生微环境，促进血管重塑、成骨细胞分化和免疫调节。其生物学效应高度依赖环境，受EVs的细胞来源、供体细胞的分化状态、疾病阶段和局部微环境等因素塑造。鉴于证据的不断积累，有必要对现有文献进行全面整合，以阐明EVs在ONFH中的作用，并识别具有转化潜力的机制通路。本综述旨在整合体外、临床前和临床研究的发现，突出EVs在骨-血管调节和免疫调节中的功能意义，并讨论其作为诊断生物标志物和治疗工具在ONFH管理中的未来应用。

**材料与方法**

**文献检索策略**

研究人员按照系统综述和荟萃分析优先报告条目（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses, PRISMA)声明进行了文献回顾。检索了PubMed、Scopus、Web of Science和Cochrane Central数据库，纳入2000年1月至2025年6月间发表的相关研究。检索词包括与细胞外囊泡、外泌体、股骨头坏死、骨生成、血管生成、免疫调节、骨再生和生物标志物相关的关键词组合。研究人员还通过审查每篇纳入文献的参考文献列表以及所在机构的灰色文献来补充检索文章。仅纳入原始实验或临床研究。

**研究选择**

研究选择由两名评审员（G.L.B.和M.M.)独立进行，依次筛选标题、摘要和全文。纳入标准包括：研究EVs（包括外泌体或微泡)在ONFH或骨、血管、免疫系统相关生物学模型中的作用。评审员之间的分歧通过讨论达成共识。

**数据提取与研究分类**

对每项纳入研究，研究人员提取了以下信息：实验模型或患者队列、EV来源和类型、EV分离和表征方法、分析技术（如蛋白质组学、转录组学、代谢组学或功能试验)，以及主要分子或生物学结局。特别关注EV与骨生成、血管生成、免疫调节和细胞代谢相关的机制。为便于解读和跨研究比较，将证据按转化相关性递增分为三类：探索EV介导调控细胞机制的体外研究；评估EVs在ONFH模型中功能和再生效应的临床前体内研究；评估EV cargo作为疾病进展潜在生物标志物或转化指标的临床研究。未进行汇总统计分析，因为提取的数据具有异质性。

**生物信息学分析**

本综述中总结的所有生物信息学分析均来源于既往发表的数据集，并重新整合用于解读目的；未进行新的原始组学分析。在报告EV cargo分子谱的研究中，使用基因本体论（GO)富集分析识别过表达的生物学过程、分子功能和细胞组分。使用Metascape进行功能聚类分析，将富集的GO术语分组为相互关联的生物学模块。评估KEGG通路富集，将EV相关分子与骨再生、血管生成、免疫调节和代谢中的经典信号通路联系起来。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI)网络，识别高度连接的节点和潜在调控枢纽。当可获得时，审阅疾病-基因关联（DISEASES)分析以评估EV衍生分子在ONFH及相关病理状况中的临床相关性。

**结果**

**体外研究**

Xiang等人（2025)报道，来源于成骨和内皮分化BMSCs的EVs通过调控SPRY4/PTPRB/TIE2/PI3K-AKT通路抑制内皮迁移和血管生成，提示其在股骨头内血管重塑中的潜在作用。值得注意的是，这些对内皮行为的影响似乎与其他报道描述的促血管生成EV活性不一致。然而，这种差异很可能反映了EV介导信号的强烈环境依赖性，受EVs的细胞来源、供体细胞的分化状态和病理微环境影响。EVs似乎并非单纯发挥促或抗血管生成效应，而是以环境特定的方式精细调节血管重塑。Wang等人（2022)的研究补充了这些发现，证明成骨分化BMSCs来源的EVs增强成骨分化的同时平衡脂肪生成，其介导标志物包括RUNX2、ALP、COL1A1和PPARγ。这些结果表明，BMSC来源的EVs不仅促进成骨细胞分化，还传递能够对抗早期骨退变的促再生信号。内皮细胞来源的EVs同样贡献于血管保护。Ma（2022)观察到，BMSCs来源的EVs通过激活PI3K/AKT/mTOR信号和自噬通路减轻糖皮质激素诱导的骨髓内皮细胞（BMECs)损伤，凸显其在应激条件下的保护作用。此外，M2巨噬细胞释放的EVs似乎影响局部免疫环境。Liu（2025)发现，这些EVs调节中性粒细胞胞外诱捕网（NET)形成并诱导内皮表型转变，促进支持组织修复的抗炎微环境。综上，这些体外研究表明EVs通过整合机制发挥作用，促进骨生成、调节血管化和调控炎症，凸显其多方面的治疗潜力。

**临床前研究**

EVs的治疗潜力得到ONFH动物模型证据的进一步支持。BMSC来源的EVs已被证明在股骨头内激活SPRY4/PTPRB/PI3K/AKT通路，增强骨生成和血管生成，同时减少坏死进展。同样，含有miR-93-5p和VEGF的M2巨噬细胞来源EVs可改善血管化、减轻炎症并防止股骨头塌陷，表明EVs可在体内协调血管和免疫调节过程。代谢组学分析进一步支持这些功能观察。Guo和Zhang（2023)在骨来源EVs中鉴定出核黄素代谢、辅酶A/泛酸生物合成、甘油磷脂代谢和鞘脂代谢的显著改变，为EVs在ONFH进展期间如何影响局部细胞代谢提供了机制性见解。这些模型中的组织学评估显示骨小梁连续性改善、骨密度增加和新血管生成增强，CD31和VEGF等标志物上调。总体而言，动物研究表明，EVs通过协调调控骨生成、血管生成、免疫应答和代谢通路发挥保护作用。BMSC来源的EVs主要促进骨小梁保留和微血管修复，而M2巨噬细胞来源的EVs通过减轻炎症信号和NET形成提供免疫调节益处。重要的是，代谢组学分析提示EV介导的再生伴随局部代谢重编程，凸显了ONFH体内疾病调控中一个尚未充分探索但可能关键的组分。

**临床研究**

临床研究已开始将临床前发现转化到人类背景中，突出EVs在ONFH中的诊断和预后潜力。患者的血清EVs和组织来源外泌体表现出反映疾病进展和潜在病理机制的独特分子特征。Sung等人（2024)分析了ONFH患者与健康对照的血清EVs，鉴定出IGHV3-23、FN1、VWF、FGB、PRG4、FCGBP和ZSWIM9为与凝血和ECM调控相关的潜在早期生物标志物。Zhu等人（2020)检查了ONFH患者与正常组织的股骨组织来源外泌体，报告CD41、RUNX2、ALP和COL1的表达改变。这些变化与成骨分化和迁移受损相关，以及黏着斑和整合素信号通路的调节。Xu等人（2025)专注于早期与塌陷期ONFH患者的血清EVs，发现SAA1、C4A和RPS8为与股骨头塌陷风险相关的候选生物标志物，并与免疫调节具有额外相关性。这些发现共同表明，EV cargo反映了ONFH中的关键病理改变，包括凝血失调、成骨受损、ECM重塑和免疫激活。

**整合生物信息学分析**

为表征ONFH中EV cargo的功能注释，对报告EV相关蛋白质和代谢物分子谱的研究进行了GO富集分析。分析既包括研究中鉴定的蛋白质，也包括使用STRING预测的额外相互作用蛋白质。富集的生物学过程包括细胞黏附、凝血、止血和参与骨骼肌再生的成肌细胞融合等相关术语。在分子功能层面，富集术语涉及ECM结构成分、蛋白酶结合、细胞黏附分子结合和结构分子活性。细胞组分分析表明，与EVs、ECM、纤维蛋白原复合物和胞外膜结合细胞器相关蛋白质的富集。

使用Metascape的功能聚类分析将富集的GO术语分组为与成骨细胞分化、内皮细胞对剪切应力的反应以及对活动的反应等相互关联的生物学模块。这些模块显示部分重叠，表明功能类别间存在共享分子组分。KEGG通路富集分析将EV相关分子映射到经典信号通路，包括PI3K-AKT、肌肉细胞中的细胞骨架、ECM-受体相互作用、补体和凝血级联以及硫胺素代谢。

PPI网络分析显示，EV相关蛋白质形成相互连接的相互作用网络。在ECM组织、免疫应答、氧化应激和代谢过程相关簇中鉴定出几个高度连接的节点。DISEASES分析识别出EV衍生蛋白质与骨坏死、血管疾病、炎症性疾病和结缔组织疾病等疾病类别之间的关联。

**讨论**

细胞外囊泡已成为股骨头坏死病理生理学中的多方面调控因子，在骨生成、血管生成、免疫调节和代谢调控的交叉点发挥作用。越来越多的证据表明，EVs并非作为孤立效应器发挥作用，而是通过转移蛋白质、微小RNA（miRNAs)、代谢物和其他生物活性分子来协调多种生物学过程的整合信号单位。在本综述中，整合生物信息学分析描绘了一个连贯的分子图景，其中EV cargo汇聚于四个主要调控领域：ECM组织、成骨分化、血管生成激活和免疫/代谢调节。在GO、KEGG、Metascape和PPI数据集中，RUNX2、COL1A1、VEGFA、ALP、SAA1以及PI3K-AKT、HIF-1和TGF-β信号组分等反复出现的枢纽作为ONFH中EV介导应答的核心驱动因素而出现。成骨、血管、炎症和代谢簇之间的重叠表明，EVs并非通过孤立通路发挥作用，而是通过反映ONFH复杂病理生理学的整合多层网络发挥作用。值得注意的是，代谢通路（包括核黄素、辅酶A、脂肪酸和鞘脂代谢)的富集扩展了EV功能的传统观点，提示其在坏死骨内细胞能量调控和脂质重塑中发挥重要作用。

**EV介导的骨生成与骨重塑调控**

大量证据支持EVs在调节ONFH成骨平衡中的作用。来源于BMSCs和成骨细胞的EVs携带参与成骨细胞分化、ECM组织和矿化的调控分子，包括RUNX2、ALP、COL1A1及相关信号网络。在临床前模型中，BMSC来源EVs的给药可改善骨小梁结构和骨密度，提示其具有对抗早期ONFH阶段成骨损伤和过度脂肪分化的能力。值得注意的是，EV介导的成骨调控似乎与血管和免疫通路紧密偶联，而非作为孤立过程发挥作用。这种整合调控可能解释了EVs为何能够在糖皮质激素暴露或缺氧等病理条件下影响间充质祖细胞命运决定，从而促成骨重塑的精细调节而非直接的骨形成诱导。

**血管生成的环境依赖性效应**

EVs在血管生成中的作用是其参与ONFH的最具争议的方面之一。多项研究通过PI3K-AKT、VEGF、HIF-1和TGF-β信号通路介导的促血管生成效应，导致临床前模型中内皮迁移、管腔形成和新生血管增强。相反，其他报告则描述了EVs（特别是来源于脂肪源性或功能障碍细胞来源)对血管生成反应的抑制或调节作用。这些发现可能反映了ONFH进展期间血管重塑的阶段特异性和微环境依赖性需求，而非真正的矛盾。在疾病早期阶段，过度血管生成可能加剧水肿、骨内压和组织损伤；而在修复阶段，受控的血管生成对于恢复灌注和支持骨生成至关重要。因此，EVs可能作为血管重塑的调节剂，根据局部病理需求调整血管生成反应，而非作为组成性的促血管生成刺激。

**免疫调节与炎症调控**

除了成骨和血管效应外，EVs还发挥日益被认为与ONFH发病机制相关的显著免疫调节功能。来源于免疫细胞（特别是M2巨噬细胞)的EVs调节炎症信号、NET形成和内皮表型转变，有助于炎症的调控。这些免疫调节效应与血管和成骨通路相交，强化了免疫、内皮和骨骼区室在ONFH中功能相互关联的概念。通过塑造局部炎症基调，EVs可能间接影响成骨细胞存活、祖细胞募集和基质重塑。

**EV功能的新兴代谢维度**

从近期研究中涌现的一个重要且相对未被充分探索的见解是EVs在ONFH期间代谢调控中的参与。骨来源EVs的代谢组学分析揭示了核黄素代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘油磷脂代谢和鞘脂通路的改变。这些发现提示，EVs可能有助于缺氧和代谢应激条件下的细胞能量稳态、氧化还原平衡和脂质重塑。鉴于代谢功能障碍可能是ONFH的特征，特别是在类固醇诱导和代谢形式的疾病中，EV介导的代谢重编程可能构成组织适应和修复中关键但未被充分认识的组分。

**转化相关性及生物标志物潜力**

尽管仍然有限，临床研究表明EV cargo在ONFH中的潜在转化相关性。ONFH患者循环EVs的蛋白质组学分析已鉴定出SAA1、C4A和RPS8等分子，反映炎症激活和代谢应激，而成骨标志物（包括RUNX2和ALP)则从研究骨再生受损的临床前EV研究中出现。这些分子特征与临床前模型的观察结果平行，支持EVs作为疾病分期和进展微创生物标志物的潜力。然而，尽管这些关联在生物学上合理且具有临床吸引力，但目前证据尚未将EVs确立为经过验证的诊断或预后工具。大多数可用研究涉及小规模队列、横断面设计和异质性方法，限制了可重复性和临床推广性。

除其生物标志物潜力外，EVs可能代表阶段性治疗策略的有前景平台；但当前证据仍主要停留在临床前阶段。其固有的生物相容性、低免疫原性以及转移成骨、血管生成、免疫调节和代谢信号的自然能力，支持其作为多模式递送系统的发展可能。在早期ONFH中，EVs富集血管生成和细胞保护cargo理论上可促进微血管恢复和成骨细胞存活，潜在地补充保关节方法。在修复阶段，EV介导的成骨分化增强和受控血管生成可能改善骨小梁重塑并优化核心减压等手术后的生物学环境。相反，在已确立股骨头塌陷的晚期阶段，EVs不太可能逆转结构损伤，但可能作为旨在调节炎症和支持骨重塑的辅助策略。新兴的生物工程方法，包括供体细胞预处理、增强骨靶向的EV表面修饰以及整合入生物材料支架，进一步提示EVs可能从内源性介质发展为可定制的治疗载体。

**局限性与未来方向**

尽管取得有前景的进展，若干局限性限制了EVs策略在ONFH中的即时临床转化。首先，EV来源、分离方法、剂量方案和分子谱分析平台存在显著异质性，使跨研究比较和可重复性复杂化。临床前模型通常无法捕捉人类ONFH的病因学和临床异质性。其次，本综述检索涉及四个主要文献数据库，不能排除使用其他数据库可能识别出额外文章的可能性。此外，现有临床研究中的有限队列规模反映了EVs和ONFH领域当前的研究早期阶段。另外，临床研究的缺乏、统计效力不足以及标准化结局指标和纵向随访的缺失也是挑战。其他挑战包括EVs生物分布、安全性和最优递送策略的不完整表征。在此背景下，未来研究还应探索EV谱分析作为靶向诊断和患者分层工具的可能性，超越纯放射学分期。同样，EVs可能代表机制指导和个性化治疗策略的框架，前提是实现稳健的标准化和临床验证。为推进行业发展，未来研究应优先考虑标准化方法框架、病因和阶段特异性分析，以及设计严谨的转化和临床研究。此外，虽然本研究聚焦于ONFH来源的EVs，但与骨关节炎和骨质疏松等相关肌肉骨骼疾病的比较分析（包括KEGG通路富集和分子谱分析)可能为共享和疾病特异性EV特征提供额外见解。虽然整合如此异质的数据集超出当前工作范围，但鼓励未来研究朝此方向推进，以增强机制理解和转化相关性。

**结论**

本综述表明，细胞外囊泡代表了理解ONFH和探索未来诊断及治疗应用的有前景途径。通过整合实验、临床和生物信息学数据，本综述独特地描绘了EVs在ONFH中的阶段性机制框架，为未来诊断和治疗策略提供转化视角。在GO、KEGG、Metascape和PPI数据集中，RUNX2、COL1A1、VEGFA、ALP、SAA1以及PI3K-Akt、HIF-1和TGF-β信号组分等反复出现的枢纽作为EV介导应答的核心驱动因素而出现。EVs整合成骨、血管生成、免疫调节和代谢信号的独特能力可用于多靶点方法。虽然EVs的诊断和治疗应用仍处于研究阶段，但继续开展支持标准化方案、可扩展生产策略和设计良好的纵向临床研究的研究，对于确定EVs能否安全有效地整合到阶段性管理算法中、潜在地改变ONFH的自然病史至关重要。