《Forensic Science International》：Development and Forensic Evaluation of an 8-dye Multi-InDel Multiplex Panel for Highly Degraded Samples
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多InDel panel结合8色荧光技术可高效分析高度降解DNA样本，检测28个位点amplicon≤125bp，热降解后等位基因检出率100%（优于传统STR的26.2%），累积父权指数达2.18×10?，符合SWGDAM指南。
贾洪涛|江宝伟|王峰|王月鹏|傅晓艺|梁斌|曲卫峰|刘毅|刘连|谢启恒|郑菲菲|文丹|唐轩|扎拉格巴伊拉|李建安
中南大学湘雅基础医学院法医学系，中国湖南省长沙市桐子坡路172号
摘要
在高降解DNA样本的分析中，仍存在重大挑战。Multi-InDel技术具有多项优势，包括高多态性、短扩增子、低突变率以及无 stutter 效应，使其成为对高降解样本进行基因分型的理想遗传标记。传统的5染料系统通常仅适用于有限数量的位点，因为需要短扩增子和有限的荧光通道数量。这一限制降低了该系统的法医效果，尤其是在涉及高降解样本的亲子鉴定中。作为经过验证的技术，8染料荧光技术能够包含更多具有短扩增子的位点，并显示出作为高降解样本法医分析的有效工具的巨大潜力。本研究介绍了一种8染料Multi-InDel试剂盒，能够同时检测28个常染色体Multi-InDel位点。所有Multi-InDel位点都被设计为产生长度不超过125 bp的扩增子，以提高与高降解样本的兼容性。即使从仅含有62.5 pg DNA的样本中，也成功获得了完整的基因分型谱型。值得注意的是，即使在100°C下热降解100分钟后，28 Multi-InDel试剂盒的等位基因检测率仍保持在100%，而商业STR试剂盒仅检测到26.2%的等位基因。该系统表现出优异的法医效率，累积匹配概率（CMP）为2.3292×10^-18，累积排除概率（CPE）为0.9999669。49个亲子三联体的平均累积亲子指数（CPI）为2.18×10^7，所有2,352个孟德尔不一致的三联体都被正确排除在亲子关系之外。综上所述，我们的结果表明，28 Multi-InDel试剂盒完全符合DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）的指南，可以成为高降解样本法医鉴定的实用、稳健且高效的方法。
引言
STR分型技术仍是法医实践中的金标准[1]、[2]。法医专家通过PCR扩增和毛细管电泳在特定STR位点获得基因型，提取遗传信息以协助案件解决或亲子鉴定。在高降解样本中经常遇到这种情况，特别是在大规模灾难、失踪人员调查、冷案以及古代遗骸检测等情境中[3]、[4]、[5]、[6]。这些样本通常保留了对法医鉴定至关重要的遗传信息。然而，商业STR试剂盒通常产生相对较长的扩增子，这在应用于高降解样本时往往导致不完整和不可靠的谱型[7]。由于DNA片段化，不完整或不可靠的结果会显著降低亲缘关系分析的可靠性[8]。
法医科学家们相继探索了SNP和indels[9]、[10]、[11]。然而，SNP的多态性较低，通常需要通过下一代测序（NGS）技术进行分析，这需要复杂的程序。尽管indels与基于毛细管电泳的基因分型兼容，但其有限的多态性降低了其在法医应用中的有效性。Kidd等人提出了一种称为微单倍型的新型法医标记，它由2个或更多相邻的SNP组成，可以生成3个或更多等位基因[12]。与微单倍型类似，黄等人于2014年首次提出了Multi-InDel作为新型法医遗传标记[13]。这些标记的特点是低突变率、短扩增子以及无 stutter 效应，使其特别适合高降解样本的分析[14]。此外，Multi-InDel标记具有长度多态性，并且与基于毛细管电泳的基因分型平台兼容。
迄今为止已经开发了几种5染料Multi-InDel多重系统，其中一些在高降解样本的基因分型中表现出明显优势[14]、[15]。然而，这些系统的法医效用受到其所包含的遗传位点数量的限制。当前多重系统设计的一个主要限制是荧光通道的数量有限，这限制了可以纳入的位点数量——特别是在需要短扩增子分析降解样本时。初步的实验室研究确定了几个Multi-InDel位点，并证明了它们在高降解样本识别中的实用性[14]。
在我们之前的工作中，我们开发了一种基于8染料的荧光STR多重系统，能够同时分析更多具有短扩增子的位点，展示了8染料荧光技术在分析高降解样本中的巨大潜力[16]。基于以往的研究，本研究旨在开发一种基于8染料的荧光多重系统，包含大量具有短扩增子的位点，以实现高降解样本的稳健法医效果。
28 Multi-InDel试剂盒的开发和验证遵循了DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）制定的指南，包括位点选择、系统优化、使用模拟样本和人群样本进行验证以及基于三联体的亲子鉴定[17]。该方法在复杂法医样本的识别中表现出稳健的性能，特别是在涉及高降解样本的亲子鉴定中。本研究中的所有实验均使用了GA118-24B毛细管电泳平台（中国公安部第一研究所，北京），该平台之前已用于法医DNA基因分型，并在参考文献[18]中有描述[18]。
章节片段
标记选择和引物设计
从1000 Genomes Project数据库（
http://grch37.ensembl.org/index.html）中筛选候选Multi-InDel位点，使用以下标准：1）每个包含的InDel位点的次要等位基因频率（MAF）大于0.1；2）每个InDel位点的插入或删除片段长度在1至125 bp之间；3）Multi-InDel内的InDel位点之间的物理距离不超过60 bp；4）所有选定的InDel位点都位于非编码区域。
标记选择和引物设计
通过整合来自三个来源[13]、[14]、[28]的候选标记，最终选择了28个位点。在引物设计过程中，检查了每个位点的引物退火区域，以避免引物结合位点内的已知序列变异（例如SNP）。只有没有明显扩增异常（例如非特异性产物或引物二聚体）的位点被保留用于构建试剂盒。这些位点的信息和引物序列见表1。
讨论
尽管法医遗传学取得了显著进展，但文献中仍缺乏对“高降解样本”的普遍接受的定义。在本研究中，高降解样本被定义为那些长度小于125 bp的片段拷贝数达到标准试剂盒检测阈值的样本，而长度大于125 bp的片段拷贝数远低于检测限。高降解样本的识别仍然是法医学中的一个主要挑战。
结论
8染料荧光技术的使用是一种有效的策略，可以增加多重试剂盒中的位点数量并提高其法医性能。在本研究中，我们建立了一种新的8染料28 Multi-InDel试剂盒，利用8染料荧光技术与PCR-毛细管电泳（PCR-CE）平台相结合。该系统包含28个常染色体Multi-InDel位点，具有高多态性。该系统表现出优异的性能，始终能够
伦理批准
本研究获得了中南大学基础医学院伦理委员会的批准（批准号2021-KT56）。所有参与者都了解了研究内容并签署了知情同意书。
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82101976）和湖南省优秀青年科学家基金（项目编号2025JJ40091）的支持。
CRediT作者贡献声明
李建安：写作——审稿与编辑、方法学、资金获取、概念构思。王月鹏：可视化、验证、监督。扎拉格巴伊拉：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据管理、概念构思。王峰：软件、资源、项目管理。唐轩：监督、资源。江宝伟：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、调查。文丹：项目管理、正式分析。贾洪涛：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢参与本研究的志愿者。
利益冲突声明
作者没有与本文内容相关的需要声明的利益冲突。数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在已发表的文章中。
