《Gene》：Deciphering the mechanism of action of metal contaminants on forensic DNA Analysis: An in-silico and in-vitro study of STR Interference
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金属污染物对 forensic DNA 分析的影响及机制研究。体外实验发现铅（Pb）与 DNA 模板结合亲和力最高（平均-1.88 kcal/mol），铁（Fe）无显著作用。FTIR 分析显示金属与 DNA 的相互作用涉及多个振动峰，RT-PCR 测试表明 0.5 mM 和 1.0 mM 镉（Cd）完全抑制 STR 扩增，铅（Pb）在 1.0 mM 时导致 80.95% 标记丢失。钙（Ca）、铬（Cr）在 1.0 mM 浓度下也有部分抑制效应。研究为金属污染防控提供机制依据。
Safiyah Tehsin|Dyaneshwar Tanpure|Sabah Shabbir|Noora R. Al-Snan|Hirak Ranjan Dash
印度奥里萨邦布巴内斯瓦尔Centurion技术与管理大学法医科学学院，邮编752050
摘要
生物样本中的外源性金属污染和内源性金属来源可能会对常规法医DNA分析流程造成挑战。本研究概述了金属依赖性多重PCR抑制的机制，包括计算机模拟（in-silico）和体外（in-vitro）实验。在测试的五种金属中，铅（Pb）对DNA模板的亲和力最高（平均为?1.88 kcal/mol），而铁（Fe）既没有与DNA模板也没有与DNA聚合酶发生任何有利相互作用。金属与DNA聚合酶的结合亲和力顺序为：Pb（?2.21 kcal/mol）> Ca（?1.74 kcal/mol）> Cd（?1.02 kcal/mol）> Cr（?0.30 kcal/mol）> Fe。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，在DNA与金属相互作用过程中涉及以下振动峰：1636 cm?1（T和G的C=O键伸缩）、1507 cm?1（G和C的平面环振动）、1477 cm?1（嘌呤环和T振动）、1397 cm?1（A、C、G、T碱基振动）、1293 cm—1（C振动）、1189 cm—1（PO2-不对称伸缩）、1068 cm—1（PO2-对称伸缩以及脱氧核糖的C-O键伸缩）。在金属存在的情况下，人类目标序列的Ct值平均增加了1.103倍，导致RT-PCR测定的DNA量减少了36.53%至70%。金属的IPC平均Ct值和降解指数分别为22.134和1.29，表明这些金属既没有显著抑制RT-PCR过程，也没有降解DNA模板。0.5 mM和1.0 mM浓度的Cd均产生了无效的STR DNA谱型。在0.25 mM、0.5 mM和1.0 mM浓度的Pb存在下，分别有33.33%、42.86%和80.95%的遗传标记出现等位基因丢失现象。Fe没有引起等位基因丢失，而Ca和Cr在高浓度（1.0 mM）下在某些遗传标记中出现了等位基因丢失。
引言
法医DNA分析技术是刑事司法系统中最确凿的证据之一。每当收集到生物样本时，无论是在亲子鉴定、谋杀案、性侵犯、骨骼残骸和 mutilated 身体识别、灾难受害者识别还是其他严重犯罪案件中，都会广泛应用这一技术（Bukyya和Tejasvi，2021）。目前的法医DNA分析依赖于毛细管电泳（CE）技术，通过序列长度分离和检测短串联重复序列（STR）等位基因。该技术正逐渐向下一代测序（NGS）技术发展，后者可以同时分析大量单核苷酸多态性（SNP）标记，从而提高区分度和分析速度。NGS技术有潜力生成许多调查线索，如预测生物地理祖先、谱系和表型特征（Safia等人，2024）。尽管在灵敏度、速度、区分度和稳健性方面取得了进展，但大多数技术仍然使用聚合酶链反应（PCR），而许多法医生物样本对PCR过程构成巨大挑战。
生成DNA谱型的成功取决于多种因素，包括回收的DNA量、DNA质量、PCR抑制物的存在与否、外源性污染以及混合来源的DNA等。无论使用何种技术，PCR都是扩增遗传标记或线粒体DNA片段进行法医DNA分析的关键步骤（McDonald等人，2024）。已在各种法医生物样本中发现了许多PCR抑制化合物，它们会对PCR过程的一个或多个环节产生不利影响。在法医生物样本中最常见的PCR抑制物包括骨骼和牙齿中的钙（Ca）、血液中的铁（Fe）、头发中的黑色素、土壤中的腐殖酸以及衣物中的靛蓝。最近的研究报告了从金属表面回收的生物样本中存在金属污染物（Bonsu等人，2023, 2023）。此外，金属表面的性质也会影响可扩增DNA的持久性。Bonsu等人（2023）发现，在金属污染物存在的情况下，RT-PCR测定的DNA量会偏高。McDonald等人（2026）在黄铜污染的情况下只能扩增少数STR标记（7-15个）。虽然金属可能对DNA分析的每个步骤产生不利影响，但只有有限的研究探讨了它们对法医DNA分析流程的具体影响。鉴于金属种类繁多且在法医生物样本中存在潜在污染的可能性，需要全面了解它们与关键PCR组分的相互作用机制及其对DNA谱型生成的影响。
除了生物样本中的天然金属成分外，外源性来源也会污染它们。当生物样本长时间暴露在金属表面时，会发生金属渗出，从而污染样本（Tehsin和Dash，2026）。暴露于环境或职业危害中的个体的生物样本通常含有多种金属污染物，如Pb、Cd、Cr、As、Hg等。患有物质使用障碍（SUD）的人的唾液、头发和血清中检测到As、Cd、Hg、Ni、Pb（Mansouri等人，2024）。随着金属外科植入物的使用增加，植入物暴露区域可能会被Ti、Al、Cr和Va等金属污染。使用金属针头或不锈钢针头采集样本时，血液样本中也报告了Co、Cr、Mn和Ni的偶发污染（Hodnett等人，2012）。因此，如果处理不当，来自各种来源的金属可能会污染法医生物样本，从而威胁常规法医DNA分析流程。为此，本研究尝试使用新一代试剂盒来了解五种候选金属污染物（Ca、Fe、Pb、Cr、Cd）对法医DNA分析流程的影响，并探讨了这些金属与模板DNA和Taq聚合酶的相互作用机制及其抑制作用。
章节摘录
金属选择与金属溶液
为了进行计算机模拟和体外分析，选择了五种金属候选物：钙（Ca）、铁（Fe）、铅（Pb）和镉（Cd）。Ca和Fe是骨骼、牙齿、肌肉和血液等生物样本中最常见的金属污染物。Pb和Cd则是来自环境来源、职业健康危害以及物质使用障碍患者的常见污染物。Cr是外科金属植入物的主要成分之一，因此也被纳入本研究。
分子相互作用研究
通过分子对接研究，表2展示了五种不同金属候选物（Ca、Cd、Cr、Fe、Pb）与十一种潜在DNA序列及DNA聚合酶之间的结合能和结合残基。在所有测试的金属中，Pb对所有DNA分子的亲和力最高（平均为?1.88 kcal/mol），除了GC富集的短序列D2S1338外。没有一种测试的DNA分子与Fe发生稳定相互作用。
本研究的意义
作为地球上最丰富的无机成分，金属对法医生物样本构成了潜在威胁。法医生物样本可能受到内源性金属和外源性污染物的影响。随着工业化进程的加快、物质使用障碍（持续用药）以及仿生系统的应用，金属污染法医生物样本的风险也在增加。法医DNA分析试剂盒正在不断改进。
结论
受金属污染的常规生物样本可能对常规法医DNA分析流程构成挑战。计算机模拟研究表明，铅（Pb）对DNA模板的亲和力最高（平均为?1.88 kcal/mol），而铁（Fe）既没有与DNA模板也没有与DNA聚合酶发生稳定相互作用。金属与DNA聚合酶的结合亲和力顺序为：Pb（结合能?2.21 kcal/mol）> Ca（结合能…
资金来源
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。
CRediT作者贡献声明
Safiyah Tehsin：撰写初稿、数据可视化、软件开发、方法设计、实验设计、数据分析。Dyaneshwar Tanpure：撰写初稿、软件开发、方法设计。Sabah Shabbir：审稿与编辑、撰写初稿、方法设计、实验设计。Noora R. Al-Snan：项目规划、监督。Hirak Ranjan Dash：概念构思、监督、手稿撰写与审稿。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢CUTM副校长提供的研究基础设施支持。同时，也要感谢巴林FSL研究与化学部门的Irfan Amjad和Yusuf Tayel Shajera在制备本研究用金属溶液方面所提供的帮助。
