TTMV::RARA融合驱动的急性髓系白血病的全面图谱：从病毒整合机制到临床结局

《Haematologica》：The comprehensive landscape of TTMV::RARA fusiondriven acute myeloid leukemia: from viral integration mechanisms to clinical outcomes

　　舒孙|刘永静|徐青宇|王佳宇|陈莉|程占瑞|高伟|王慧丽|杨蓓|王海燕|文丽军|肖健|娄家成|于海波|李娜|王峰|谢洋洋|王金刚|王先静|薛红娟|朱红虎
中国北京首都医科大学朝阳医院血液科

具有TTMV::RARA融合的急性髓系白血病（AML）是一种新型亚型，其形成是由于torque teno mini病毒（TTMV）整合到视黄酸受体α（RARA）基因位点所致。目前对这种亚型的分子特征和临床表现的理解主要基于个别病例的观察。在本研究中，我们通过整合临床组学数据对一个大型独立队列（N=25）进行了分析，揭示了其区别于经典急性早幼粒细胞白血病（APL）和其他AML亚型的独特特征。我们的研究发现，TTMV通过微同源性介导的末端连接方式特异性地整合到RARA基因的内含子2中，形成具有功能的TTMV::RARA转录本。临床上看，携带这种融合基因的患者主要为儿童（72%，年龄<18岁），并且常伴有髓外疾病（24%为髓系肉瘤，16%为中枢神经系统浸润）。白血病细胞的形态学和免疫表型类似于APL，但缺乏PML::RARA融合基因，而是携带具有i(17)(q10)异常的TTMV::RARA融合基因（24%）。无监督聚类分析表明这是一个分子上不同的亚群。转录组分析显示，该亚群具有Wnt通路激活和细胞外基质失调的特征，通过克隆扩增和转移途径促进白血病发生。尽管诱导治疗可使96%的患者达到完全缓解，但长期预后较差，2年无事件生存率和无复发生存率分别为53.6%和53.8%。造血干细胞移植在11名患者中中有9名实现了持久缓解，尤其是那些伴有髓外疾病或i(17)(q10)异常的患者。总之，这项研究确立了TTMV::RARA作为一种新的AML亚型，强调了在APL样病例中进行病毒筛查的必要性，并指出应优先考虑对这些患者进行造血干细胞移植。

**引言**
急性髓系白血病（AML）是一组分子异质性较高的恶性肿瘤，其特征是染色体重排和基因异常。大约40%的AML病例携带由这些重排产生的临床验证的致病性融合基因。关键融合基因（如PML::RARA）已被确立为AML的诊断标志物和治疗靶点，因为它们具有独特的临床病理特征和预后相关性。世界卫生组织（WHO）已将这些分子改变纳入血液淋巴肿瘤的分类体系中，显著改善了患者的管理和治疗效果。然而，仍有一部分AML患者缺乏明确的分子标志物，这为精准医学中的新型致癌驱动因素的鉴定带来了迫切需求。最近的研究发现，传统上被认为是非致病性的torque teno mini病毒（TTMV）可以异常整合到人类基因组的视黄酸受体α（RARA）位点，形成跨物种的“病毒-宿主”融合基因TTMV::RARA。这种独特的基因组重排直接导致了具有急性早幼粒细胞白血病（APL）特征的AML的发展，从而挑战了传统上认为白血病是由人类基因融合引起的观点，并扩展了我们对AML发病机制的理解。尽管先前的病例报告已经描述了这种融合的基本结构特征，但病毒整合的精确机制仍不清楚。同样，尽管临床观察记录了一些表型特征，但基于证据的治疗共识和治疗指南仍需通过大规模研究进行系统验证。为了解决这些关键知识空白，我们迄今为止收集了一个包含25例TTMV::RARA病例的多中心队列。这一扩展的数据集使我们能够构建病毒整合模式的全面分子谱型，建立基因型与临床表现之间的关联，并评估治疗反应模式，以指导基于证据的治疗指南的制定。

**方法**
**病例识别和研究设计**
这项观察性回顾性队列研究（批准编号2024-7-31-2）获得了中国首都医科大学朝阳医院伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言进行。初始TTMV::RARA筛查的队列包括2,553名AML患者，其中2,543例来自已发表的数据库（在线补充表S1），另外10例来自2014年7月至2024年8月期间的多中心研究。这10例患者表现出与经典APL高度相似的形态学和免疫表型特征，但没有携带已知的APL定义基因（包括经典的PML::RARA以及其他与人类基因融合的RARA、RARG或RARB），也没有与APL样表现相关的热点NPM1突变。通过应用严格的筛选策略（包括病毒基因组数据），我们最终确定了4例携带TTMV::RARA融合事件的患者。这一高频率强调了TTMV在解决未分类APL样病例中的潜在诊断价值。新鉴定的TTMV::RARA阳性患者的诊断和随访信息由参与中心提供，而已发表的病例数据则从文献中提取。收集的数据包括患者人口统计学信息、诊断/临床实验室结果、形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子遗传学（MICM）分析结果、诱导/巩固化疗方案以及造血干细胞移植（HSCT）详情。治疗决策系统地记录在医疗记录中。所有患者均被随访至死亡或数据截止日期（2024年8月）。

**基于表达的比较**
转录水平表达量使用Salmon（v1.9.0）进行量化，基因水平读数使用tximport R包汇总。为了最小化批量效应，使用DESeq2（v1.40.2）分析了TTMV::RARA样本的集成数据集和一个独立数据集（GSA-Human数据库，访问ID HRA002693）的差异表达。使用EnhancedVolcano R包可视化DE结果。基因表达水平的方差稳定转换通过DESeq2完成。无监督层次聚类使用Ward.D2算法进行。基因集富集分析使用clusterProfiler21 R包进行，并通过GseaVis R包进行可视化。

**结果定义**
完全缓解（CR）和总体缓解根据推荐标准定义。总生存期（OS）定义为从初次诊断到最后一次随访的时间，随访结果为死亡或存活。无事件生存期（EFS）从初次诊断到治疗失败（患者在第6个月时未达到CR）、复发或最后一次随访的时间。无复发生存期（RFS）从首次CR到首次复发、死亡或最后一次随访的时间。

**统计分析**
统计分析使用R软件（v4.4.0）和GraphPad Prism（v10.1.2）进行。差异表达分析使用Wald检验，生存分析包括Kaplan-Meier曲线和log-rank检验用于组间比较，Cox比例风险回归用于多变量分析。P<0.05被认为具有统计学意义。多重检验校正采用Benjamini和Hochberg方法。

**TTMV::RARA临床和组学数据集的建立**
为了系统地识别RARA位点的TTMV整合，我们筛查了2,543个公开可用的AML RNA测序（RNA-seq）数据集和10个APL样病例（图1）。经过严格的多步骤筛选（在线补充图S1），我们确定了10例携带TTMV::RARA融合的病例（图1）。通过纳入之前研究中的15例病例，我们建立了一个包含25名患者的综合数据集。该数据集包括所有25例患者的临床资料、15例患者的RNA-seq数据以及2例患者的全基因组测序（WGS）数据（图1）。

**急性髓系白血病中TTMV整合的一般模式**
对携带TTMV::RARA的AML患者的RNA-seq和WGS数据进行整合分析，发现了7种不同的TTMV菌株参与融合基因的形成。其中，TTMV菌株MN769771.1最为常见，占所有融合事件的46.7%（图2A，B）。定位分析确认所有TTMV整合事件均局限于RARA基因的内含子2，且明显偏好3’端断裂区域（图2A；在线补充图S2A）。这一发现与文献中的先前观察结果一致。值得注意的是，插入位点表现出显著的聚集性，表明该区域可能存在潜在的热点整合位点（P=0.00178；图2A）。对15个整合位点的序列分析显示，在12例（80%）中存在2到4个碱基对的微同源性，微同源性介导的末端连接（MMEJ）可能是大多数患者中TTMV-宿主整合的驱动机制。

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**图1. TTMV筛查和急性髓系白血病患者中TTMV::RARA特征的研究设计。该示意图展示了torque teno mini病毒-视黄酸受体α（TTMV::RARA）在急性髓系白血病（AML）中的分析流程。对25例携带TTMV::RARA融合的AML病例（其中10例为新发现，15例来自已发表的报告）进行了系统分析，揭示了TTMV的独特整合模式以及TTMV::RARA患者的独特转录谱型和临床表现。**

**TTMV::RARA转录本的结构特征**
融合转录本的分析显示，15例患者中有13例（86.7%）携带嵌合的RARA::TTMV::RARA转录本，TTMV位于5’和3’ RARA片段之间（在线补充图S2B和S3A，B；在线补充表S2）。这些发现与先前的报告一致，并提供了全长RARA::TTMV::RARA前体转录本存在的证据（图2C）。对融合转录本的深入序列分析发现了三个独特的结构特征：所有13例患者中都检测到一个高度保守的基序位于TTMV起始密码子附近（在线补充图S4A），而下游的RARA开放阅读框保持完整。此外，RARA内含子2序列的保留程度各不相同（范围从0到45个碱基对）（图2D）。这种三部分结构表明存在功能层次结构：5’ RARA片段可能作为调节性非翻译区（UTR），使保守的TTMV基序和完整的RARA开放阅读框（ORF）保持翻译效率。RARA内含子2序列的可变保留进一步表明这种致癌融合转录本的剪接调控机制，强调了病毒整合通过调控基因表达来驱动白血病发生的复杂机制。

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**图2. TTMV病毒插入急性髓系白血病基因组的特征。(A) Torque teno mini病毒（TTMV）插入视黄酸受体α（RARA）内含子2的不同位置。红色阴影表示病毒和宿主DNA在插入位点的序列同源性，热点区域表示多个样本中的插入位点所在的短基因组片段。(B) 15例TTMV::RARA患者中插入RARA基因的TTMV病毒亚型类型和比例。(C) 图示了RARA::TTMV::RARA融合基因的潜在可变剪接模式。(D) 剪接后的TTMV::RARA融合转录本中RARA外显子3之前保留的内含子2序列的长度（碱基对）分布。每列代表一个TTMV::RARA样本。**

这些发现全面描述了嵌合RARA::TTMV::RARA转录本的结构，这些转录本通过TTMV病毒整合到人类基因组中保持了功能性的TTMV::RARA ORF。这些观察结果促使我们进一步探究这些融合基因所介导的临床和表型关联。

**携带TTMV::RARA的急性髓系白血病患者的临床特征**
为了阐明携带TTMV::RARA融合基因的AML患者的临床和分子特征，我们全面分析了25例患者。该队列主要由18岁及以下的个体组成（72%，18/25），性别分布大致相等（男性：女性 = 13:12）（表1）。诊断时，发热（36%，9/25）和出血（32%，8/25）是最常见的临床表现（表1）。血液学参数显示白细胞（WBC）计数、血红蛋白和血小板计数的中位值分别为7.88×10^9/L（范围，1-41.9×10^9/L）、88 g/L（范围，55-113 g/L）和94×10^9/L（范围，13-334×10^9/L）（表1）。凝血学检查显示凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间的中位值分别为13.55秒和32.6秒，纤维蛋白原和D-二聚体水平分别为196 mg/dL和10,660 μg/L（表1）。值得注意的是，24%（6/25）的病例表现出髓系肉瘤，16%（4/25）有中枢神经系统（CNS）浸润，反映了疾病的侵袭性（表1）。

携带TTMV::RARA融合的AML患者的MICM分析显示，与经典APL相比既有显著相似之处也有明显差异。形态学上，52%（13/25）的白血病细胞表现出典型的APL颗粒增多特征，而8%（2/25）表现出颗粒减少的APL变体特征。此外，32%（8/25）的病例中观察到Auer小杆（表1；图3A）。流式细胞术分析显示，大多数白血病细胞中CD33（100%）、CD13（100%）、CD117（79%）、MPO（100%）、CD99（100%）和CD38（87.5%）的表达水平较高，而CD34（16.7%）、HLA-DR（10%）和CD11b（15%）的表达则较为罕见（图3B），这与APL的免疫表型特征一致。相反，细胞遗传学和分子分析揭示了携带TTMV::RARA的AML患者的独特特征。在25名患者中，有60%（15/25）存在染色体异常，其中等臂染色体i(17)(q10)（24%，6/25）和三体8（8%，2/25）是最主要的异常类型（表1）。此外，通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）、下一代测序（NGS）靶向测序和批量RNA-seq分析等综合方法系统筛查复发白血病突变，仅发现1例FLT3内部串联重复（FLT3-ITD）、2例NRAS p.G12密码子突变和2例WT1突变（图3C）。这些突变在APL中较为常见，表明该亚型具有独特的突变特征。综上所述，虽然携带TTMV::RARA的AML患者在形态学和免疫表型上与经典APL相似，但在细胞遗传学、分子学和临床特征上存在显著差异。

为了确定携带TTMV::RARA融合基因的AML患者是否代表一个独立于传统AML和经典APL的亚型，我们对15个TTMV::RARA样本进行了转录组分析，并将其与53个PML::RARA（经典APL）样本和511个非APL AML样本进行了比较（在线补充表S3）。无监督层次聚类分析显示，TTMV::RARA样本形成了一个转录上不同的簇。尽管它们与经典APL有密切关系，但两者之间存在明显的分离（图3C），表明这些亚型之间存在潜在的分子差异。

表1. 携带TTMV::RARA急性髓系白血病的临床特征（N=25）。

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图3. 携带TTMV::RARA的急性髓系白血病的临床特征和转录组景观。(A) 携带TTMV::RARA的患者的骨髓穿刺形态显示，原始髓细胞具有单叶至双叶核轮廓和密集的紫色胞质颗粒。(B) TTMV::RARA患者的免疫表型特征显示，大多数白血病细胞表达CD38、CD117、CD13、CD33和MPO。少数样本表达CD34、HLA-DR和CD11b。(C) 热图显示了15个TTMV::RARA患者、53个PML::RARA患者以及511个无TTMV::RARA或PML::RARA的急性髓系白血病（AML）患者之间的转录组数据无监督聚类结果。(D, E) 火山图分别显示了TTMV::RARA患者与经典急性早幼粒细胞白血病（APL）之间的差异表达基因（DEG）。(F) 火山图显示了携带i(17)(q10)的患者与不携带i(17)(q10)的患者之间的DEG。

差异基因表达和功能分析显示，携带TTMV::RARA的AML患者表现出RARA基因的高表达以及Wnt信号通路的显著富集（图3D, E；在线补充图S5A, B），这些与细胞增殖和自我更新相关。同时，细胞外基质（ECM）调节因子如ADAMTS9和MMP8也表现出显著过表达（图3D, E；在线补充图S5A, B），这与它们在组织重塑和侵袭性迁移中的作用一致。这些发现支持了一种双重机制模型：Wnt通路的激活驱动克隆扩增，而ECM的失调促进了携带TTMV::RARA的AML患者的转移。进一步利用相同的无监督聚类方法对15个TTMV::RARA AML样本进行分层后，发现了两个不同的亚组（图3C）。这两个亚组通过是否存在等臂染色体i(17)(q10)来区分，该染色体异常在5名患者（33.3%）中通过G带核型分析和转录组数据的综合分析被检测到。比较转录组分析显示，i(17)(q10)阳性亚组（N=5）与i(17)(q10)阴性亚组（N=10）相比，有678个基因显著下调（倍数变化>2；调整后的P值<0.05），其中TP53的表达下降了4.2倍（调整后的P值=0.003；图3F）。通路富集分析（GSEA）显示，i(17)(q10)阳性亚组在与染色体着丝粒核心结构（NES =-2.03；P<0.001）和DNA双链断裂反应（NES =-2.21；P<0.001）相关的通路中表现出显著富集（在线补充图S5C）。这些发现结合TP53在DNA修复中的已知作用，表明i(17)(q10)阳性亚组的DNA损伤修复能力受损。值得注意的是，i(17)(q10)在AML中的发生率低于1%，这突显了携带TTMV::RARA的AML的独特分子特征。这些独特特征将TTMV::RARA患者与经典APL和其他AML亚型区分开来，需要进一步的临床和机制研究。

对携带TTMV::RARA的AML患者的治疗反应分析显示，诱导治疗后的总体完全缓解（CR）率为96%（表2）。然而，只有46%的患者在第一次治疗疗程后达到CR。诱导治疗后的45天内没有早期死亡病例，表明对初始治疗的耐受性良好。携带TTMV::RARA的AML患者主要接受了三种初始诱导方案中的一种：全反式维甲酸联合三氧化二砷（ATRA+ATO，疗程超过14天，N=9）、短疗程ATRA联合化疗（N=7）和标准AML诱导化疗（N=8）。如表2所示，ATRA+ATO、短疗程ATRA联合化疗和标准化疗的CR率分别为66.7%、28.6%和50%，总体反应率分别为88.9%、71.4%和62.5%。尽管Fisher精确检验未显示三组治疗之间的CR率存在统计学显著差异（P=0.319），但ATRA+ATO组的CR率和总生存期（OS）相对较高（在线补充图S6A-C）。治疗反应的趋势表明，ATRA+ATO联合疗法可能对诱导缓解有积极作用，因此需要更大样本量的进一步研究。值得注意的是，携带等臂染色体i(17)(q10)的患者表现出显著的治疗抵抗性，CR率为16.7%（1/6），总体反应率为50%（3/6）（表2）。

表2. 治疗反应（N=25）。

共有11名患者接受了造血干细胞移植（HSCT），包括10例异基因移植和1例自体移植。其中，5例患有髓系肉瘤或中枢神经系统受累，1例携带i(17q10)染色体异常，这些都是高风险预后标志。临床结果分析显示，在11名患者中，1例在移植后50天内因多器官受累而复发并死亡，另一例在移植后24个月因疾病进展而死亡。其余9名患者在最后一次随访时仍然存活，中位随访时间为36个月（范围7.7-115.5个月）。值得注意的是，其中两名患者分别在移植后8年和9年仍处于缓解状态。

生存分析显示，2年OS、无事件生存期（EFS）和无复发生存期（RFS）率分别为84.6%（95%置信区间[CI]：59-94.8%）、53.6%（95% CI：30.8-71.8%）和53.8%（95% CI：31.1-72%）（图4A-C）。与接受ATRA+ATO治疗的经典APL患者相比，携带TTMV::RARA的AML患者的EFS和RFS显著较低。

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图4. 携带TTMV::RARA融合基因的急性髓系白血病的临床结果和治疗反应。(A-C) 携带TTMV::RARA融合基因的急性髓系白血病（AML）患者的总体生存（OS）、无事件生存期（EFS）和无复发生存期（RFS）。

讨论

本研究系统地筛查了2,553例AML病例，以提供TTMV整合到人类RARA基因的具体证据。通过国际多中心合作整合临床和多组学数据，我们全面描述了与TTMV::RARA融合基因相关的结构特征和临床表现，为这种血液系统恶性肿瘤的精准医疗框架的建立提供了关键证据。与之前发现的八种致病病毒不同，TTMV是首个通过产生嵌合融合癌基因直接诱导肿瘤发生的单链DNA病毒。其致癌机制独立于经典途径，如病毒癌蛋白的表达、基因组不稳定或细胞周期的失调，从而扩展了病毒致癌的理论框架，并为病毒肿瘤学领域提供了重要见解。我们对TTMV整合模式的分析揭示了两个关键特征。首先，TTMV可以从其基因组的任何区域整合到RARA基因的内含子2中，并在不同患者中表现出显著的病毒亚型异质性。这种空间随机性和菌株多样性给临床检测带来了挑战，强调了在AML中进行全面病毒整合筛查的必要性，特别是在表现出类似APL形态的病例中。其次，我们观察到TTMV对RARA内含子2有明显的偏好，并确定了一个反复出现的整合热点，将TTMV MN769771.1指定为主要致病亚型。MMEJ可能是促进这种位点特异性整合的重要机制。这些发现有助于更深入地理解病毒和宿主基因组在白血病发生中的相互作用，并具有临床意义。已识别的反复整合模式可作为诊断工具的开发依据。

尽管早期研究表明携带TTMV::RARA的AML与经典APL之间存在相似性，但我们的研究证实了这一亚型的独特临床和分子特征，这与Zhou等人的发现一致。该亚型主要影响儿童群体，并以髓外受累和反复出现的i(17)(q10)异常为特征，这些在经典APL或其他AML亚型中较为罕见。转录组分析进一步明确了其独特的基因表达谱，证实了其作为独立疾病实体的分类。目前，尚无针对这种疾病的确立诱导疗法。先前的研究表明，TTMV::RARA融合蛋白对ATRA具有剂量依赖性反应，然而RARA配体结合域内的突变容易导致治疗抵抗。TTMV::RARA的预测蛋白结构表明，TTMV ORF中的C55/C57/C59残基可能形成砷结合位点，从而增强对ATO的敏感性。我们的研究提供了直接临床证据，支持ATRA+ATO在这些患者中的有效性，并显示出改善OS的趋势，因此支持其作为一线治疗选择的潜力。利用无监督聚类分析，我们将携带TTMV::RARA的AML患者进一步分为两个具有显著分子异质性的亚组，这些亚组与临床结果密切相关。高风险亚组以i(17)(q10)异常的普遍存在为特征，表现出极差的预后和对传统疗法（包括ATRA+ATO）的有限反应。机制研究表明，这一高风险亚组表现出TP53表达下调和DNA损伤修复通路激活，这可能解释了其化疗抵抗性表型。值得注意的是，HSCT在这一亚组中显示出有希望的效果，为解决治疗挑战提供了可行的策略。

尽管本研究的样本量有限，但它代表了迄今为止最大的TTMV::RARA病例全球队列之一。我们关于临床表现、整合机制和治疗反应的观察结果与另一独立TTMV::RARA病例队列的报告高度一致，进一步证实了我们结论的有效性，并强调了多中心合作在研究罕见血液系统恶性肿瘤中的重要性。迄今为止，已有近40例病例在两个独立队列中被记录，表明这种恶性肿瘤的实际发病率可能被低估，主要是由于当前诊断工作流程中缺乏常规的病毒整合筛查。应承认，有限的样本量限制了亚组分析的统计功效。我们队列中FLT3-ITD、NRAS/KRAS和WT1突变的频率低于先前发表的队列。这些差异可能反映了潜在的人群异质性、招募标准的差异或疾病的固有分子多样性。因此，未来的研究应旨在整合来自多个中心的数据并增加样本量，以系统地描述这种疾病的临床-分子谱型，并验证此处提出的风险分层模型。同时，彻底研究TTMV::RARA融合蛋白引发的白血病发生机制、开发高灵敏度的诊断方法和靶向治疗是未来研究的重要目标。

总之，本研究通过全面检查与TTMV::RARA相关的分子机制和临床表型，将其确立为AML的一个新亚型，并提出了初步的风险分层诊断和治疗策略。鉴于TTMV::RARA阳性AML的独特生物学行为和不良预后，我们建议在基于下一代测序的临床诊断方案中包含病毒基因组检测，以提高检测率。我们目前正在开展进一步的机制研究，旨在解决这些关键的生物学问题，并在未来提供更实质性的证据。

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