从命中化合物到先导化合物：喹唑啉二酮骨架的系统优化作为强效且无细胞毒性的抗疟药物

《ACS Omega》：From Hit to Lead: Systematic Optimization of the Quinazolinedione Scaffold as Potent and Noncytotoxic Antimalarial Agents

　　

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）对以青蒿素为基础的疗法产生耐药性，迫切需要发现具有新颖骨架和作用机制的新型抗疟药物。喹唑啉二酮（quinazolinedione）骨架以特雷斯卡托斯抗疟化合物集（Tres Cantos Antimalarial Set, TCAMS）中的命中化合物TCMDC-125133为代表，被鉴定为一种有前景且无细胞毒性的起点。 herein，研究人员报道了一项系统的先导优化研究，起始自一个简化的、具有合成可及性的类似物——化合物9（IC₅₀ = 586 nM），该化合物此前由该研究团队报道。通过简洁的5步路线，设计并合成了一组包含57种新型衍生物的聚焦化合物库，系统性地探索了末端苯基侧链以及喹唑啉二酮核心骨架的结构-活性关系（structure–activity relationship, SAR）。研究揭示了两个关键发现：（i）3,4-二氟苯基侧链对于活性最为理想；（ii）在核心骨架上引入小的吸电子卤素取代基具有高度益处。该策略促成了化合物53的发现，其将6,7-二氟核心与3,4-二氟苯基侧链相结合，对恶性疟原虫3D7株表现出强效的IC₅₀为116 nM。关键的是，这一强效类似物以及该系列中的每一种化合物均对人HepG2细胞表现出可忽略不计的细胞毒性（IC₅₀ > 20 μM），表明其具有高选择性。该研究证实了7-卤代喹唑啉二酮骨架作为一种有前景且选择性的化学型（chemotype），可用于进一步的抗疟药物开发。

该论文发表于《ACS Omega》，研究团队针对恶性疟原虫对青蒿素联合疗法产生耐药性这一紧迫的公共卫生问题，开展了喹唑啉二酮骨架的系统先导优化研究。疟疾仍然是全球重大健康负担，世界卫生组织2023年报告约2.63亿例病例和59.7万例死亡，其中恶性疟原虫导致大多数病例。青蒿素联合疗法作为一线治疗方案正面临严重威胁，因为在东南亚和非洲已出现并快速传播对青蒿素部分耐药恶性疟原虫株。为应对这一挑战，全细胞表型筛选已成为现代抗疟药物发现的重点方向。葛兰素史克公司发布的特雷斯卡托斯抗疟化合物集为抗疟研究社区提供了超过13000个命中化合物，其中喹唑啉二酮骨架因TCMDC-125133的鉴定而备受关注。该化合物对恶性疟原虫3D7株具有强效活性（IC₅₀ ≈ 200 nM）且毒性低，相关化合物MMV665916和MMV019066对寄生虫生活周期多个阶段均有效，与近期成功的二氢喹唑啉酮-3-甲酰胺类PfATP4抑制剂先导优化项目具有结构相似性。

研究团队此前对TCMDC-125133的研究识别出化合物9，该化合物以消旋的乙基取代原始手性异丙基基团，保持了亚微摩尔活性（IC₅₀ = 586 nM）。选择化合物9作为新起点是基于战略考量：其消旋体性质使合成过程更简单、更具成本效益，且可从廉价化学品出发进行合成，符合抗疟研究社区设定的目标产品特征。

研究人员采用的关键技术方法包括：（1）基于结构-活性关系（SAR）的理性药物设计策略，系统修饰末端苯基侧链和喹唑啉二酮核心；（2）简洁高效的5步合成路线，包括异酸酐形成、氨基酸酯开环、环化、皂化及酰胺偶联等关键步骤；（3）针对恶性疟原虫3D7株的SYBR Green荧光抗疟活性测定；（4）人肝肿瘤细胞HepG2的MTT细胞毒性评估；（5）SwissADME计算预测工具进行药代动力学特性分析。

研究结果部分首先介绍了合成路线。研究人员从化合物9出发，采用先前报道的简洁5步合成路线生成57种喹唑啉二酮衍生物库。合成以取代邻氨基苯甲酸为起始原料，经三光气处理形成异酸酐中间体，再与甲基-(dl)-2-氨基丁酸酯盐酸盐在碳酸钾存在下进行开环反应，获得关键氨基酸酯中间体。环化步骤采用1,1'-羰基二咪唑（CDI）或三光气实现，随后经氢氧化锂皂化得到羧酸中间体，最后通过HATU介导的酰胺偶联反应与多样化苯胺反应，经柱层析或重结晶纯化得到最终目标化合物。

在末端苯基侧链的结构-活性关系优化方面，研究人员首先假设化合物9的3-甲氧基作为氢键受体发挥作用。通过将甲氧基替换为单卤素等基团以调控苯环电子特性，发现化合物11（3-氟苯基，IC₅₀ = 1277 nM）、化合物13（3,4-二氟苯基，IC₅₀ = 693 nM）和化合物17（3-氯-4-氟苯基）在1 μM浓度下抑制率优于化合物9。特别地，3,4-二氟苯基类似物化合物13表现出该系列最佳活性。相反，去除甲氧基或替换为苄基（化合物20）或对茴香基（化合物21）导致抗疟活性急剧下降。吡啶类似物（化合物18和19）尽管被考虑为氟苯的生物等排体，却显示出显著降低的抗疟活性，提示结合口袋区域存在特定的电子或构象需求。该系列研究明确了3,4-二氟苯基作为增强抗疟活性的优选取代基。这一结构-活性关系趋势在7-甲氧基、7-氟、7-氯、6,7-二氟取代喹唑啉二酮核心以及7-氮杂喹唑啉二酮骨架的多个衍生系列中均得到验证。

在喹唑啉二酮核心的优化方面，研究人员在确立3,4-二氟苯基为优选侧链后，考察了6位和7位取代对活性的影响。比较不同C7取代但具有相同3,4-二氟苯基侧链的衍生物（化合物13、26、35、44、53和62）发现，未取代的化合物13（IC₅₀ = 693.0 nM）引入小取代基后活性显著提升：化合物35（7-氟，IC₅₀ = 292.9 nM）、化合物44（7-氯，IC₅₀ = 191.3 nM），而化合物53（6,7-二氟）以116.2 nM的IC₅₀成为整个化合物库中最强效的化合物，较化合物13提升近6倍。相比之下，较大或电子特性不同的基团如化合物26（7-甲氧基，IC₅₀ = 749.0 nM）和化合物62（7-氮杂生物等排体，IC₅₀ = 706.7 nM）未带来改善。研究还建立了亲脂性与活性的关联，维持log P值高于3对于实现高抗疟活性至关重要。

在细胞毒性评价方面，所有合成化合物对人肝细胞HepG2均表现出可忽略不计的细胞毒性，IC₅₀值均大于20 μM。先导化合物53（Pf3D7 IC₅₀ = 116 nM；HepG2 IC₅₀ > 20 μM）的选择性指数（selectivity index, SI）超过170，展现出优异的体外安全性特征。

在讨论部分，研究人员将本研究的喹唑啉二酮衍生物与二氢喹唑啉酮-3-甲酰胺类PfATP4抑制剂进行了比较。两类化合物在芳环卤代增强抗疟活性方面具有共同设计特征，特别是在核心骨架和侧链上策略性放置吸电子卤素原子，提示可能作用于相同或非常相似的生物靶标。研究人员建议未来需开展的关键研究包括：通过耐药性选择结合全基因组测序明确分子靶标；对已知PfATP4突变株和其他多重耐药临床分离株进行抗药性谱分析；评估配子体形成抑制和 transmission-blocking 活性；对消旋体进行手性分离和单一对映体评价；以及开展体外药物代谢动力学（DMPK）研究和体内药效学验证。

研究结论指出，该研究通过稳健的五步合成路线对喹唑啉二酮骨架进行了系统的先导优化。结构-活性关系研究确立了3,4-二氟苯基为最优侧链，并证明核心卤代是增强活性的有效策略。化合物53（6,7-二氟核心）达到了116 nM的强效IC₅₀，较起始点提升5倍，选择性指数超过170。与7-氮杂生物等排体不同，C7位的氟和氯取代提供了理想的电子特征以促进靶标结合，这些修饰还可能作为代谢阻断剂增强未来DMPK研究中的稳定性。该工作证实了6,7-二氟喹唑啉二酮骨架作为有前景抗疟药效团的价值。为进一步推进这类喹唑啉二酮衍生物的开发，必须进行深入研究以明确分子靶标，对耐药株进行全面抗性谱分析，评估其 transmission-blocking 潜力，开展手性分离及对映体单独评价，并进行体外DMPK研究及随后的体内动物模型药效验证。