《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Growth factor-free chondrogenesis and immunomodulation of Wharton’s jelly MSCs on chitosan-hyaluronic acid films
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为应对关节软骨损伤修复困难、现有治疗易形成纤维软骨的临床挑战，研究人员聚焦软骨组织工程，利用天然聚电解质逐层自组装技术构建了壳聚糖-透明质酸（CHI-HA）10多层膜支架，并探究其对沃顿胶来源间充质干细胞（WJ-MSCs）的软骨分化及免疫调节作用。研究表明，该多层膜可在无需外源性转化生长因子β（TGF-β）条件下，有效诱导WJ-MSCs向软骨细胞自发分化，并增强其抗炎细胞因子IL-10的分泌，选择性调节Toll样受体（TLR）表达，为研发新型、无生长因子的软骨修复策略提供了创新平台。
关节软骨，这个在人体关节中默默承担缓冲与润滑重任的精密组织，其自我修复能力却极为有限。无论是运动损伤还是随着年龄增长出现的慢性磨损，一旦损伤形成，身体自身难以再生出与原生组织性能相同的透明软骨。当前的治疗手段，如手术或对症治疗，常常导致结构、力学性能都稍逊一筹的纤维软骨增生，这无疑为患者的长期生活质量埋下了隐患。这一困境促使科学家们将目光投向了软骨组织工程——一个旨在“重建”功能化软骨的领域。该领域的核心要素包括生物相容性好的支架、具有强大分化潜能的种子细胞以及能够指导细胞定向分化的生长因子。然而，传统上用于诱导软骨分化的关键因子——转化生长因子β（TGF-β）价格昂贵、性质不稳定，其长期应用还可能引发肥大等不良副作用。那么，能否构建一种生物材料支架，使其不仅能支持细胞生长，还能模拟细胞天然的微环境，在不依赖昂贵且不完美的外源性生长因子的情况下，主动引导干细胞定向分化为我们所需的软骨细胞呢？发表在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》上的一项研究，正是为了回答这个充满挑战又极具前景的问题。
本研究主要采用了以下几个关键技术方法：首先，研究人员从健康足月新生儿脐带中通过外植块法分离并鉴定了沃顿胶来源间充质干细胞（WJ-MSCs），确认其符合国际细胞与基因治疗学会的标准。其次，利用逐层自组装技术，在经处理的玻片表面交替沉积壳聚糖和透明质酸溶液，构建了十层的（CHI-HA）10聚电解质多层膜支架。实验设置了在（CHI-HA）10膜上培养的WJ-MSCs（实验组）、在（CHI-HA）10膜上培养并添加TGF-β的WJ-MSCs（阳性对照组）以及在普通玻片上培养的WJ-MSCs（阴性对照组）三组，持续培养21天。随后，综合运用了形态学观察、流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹、组织化学染色（甲苯胺蓝染色）以及酶联免疫吸附测定等分子生物学和细胞生物学技术，系统评估了细胞的软骨分化情况及其免疫调节特性。
研究结果
3.1 WJ-MSCs的表征
分离得到的细胞具有贴壁生长、成纤维细胞样形态，并高表达间充质干细胞标志物CD44、CD90、CD73，而不表达造血标志物CD34、CD45，符合WJ-MSCs的特性。
3.2 （CHI-HA）10支架上的细胞形态
培养过程中，实验组和阳性对照组的细胞均发生了显著的形态学变化，从最初的成纤维样逐渐形成球状聚集体，最终在第21天呈现出圆形的软骨细胞样形态，表明成功的软骨分化。
3.3 流式细胞术分析
培养21天后，与阴性对照组相比，实验组WJ-MSCs的CD44和CD73表达显著下调，而CD34在实验组中被检测到，CD90表达无显著变化。这些表面标志物的变化进一步证实了细胞从间充质干细胞向分化状态的转变。
3.4 软骨形成及多能性标志物在转录水平的评估
实时定量聚合酶链式反应结果显示，在（CHI-HA）10支架上培养的WJ-MSCs，其多能性基因Sox2表达下调，而关键的软骨形成基因Sox9和蛋白聚糖（Aggrecan）表达显著上调，表明转录水平上发生了软骨分化。
3.5 通过蛋白质印迹评估蛋白表达
蛋白质印迹分析证实，实验组WJ-MSCs的Sox9蛋白表达水平相比阴性对照组显著增加了5倍，与阳性对照组（增加6倍）效果接近，在蛋白质水平验证了（CHI-HA）10支架诱导软骨分化的能力。
3.6 使用甲苯胺蓝染色的功能评估
甲苯胺蓝染色结果显示，实验组和阳性对照组的细胞外基质均呈现强烈的蓝色着色，表明有丰富的硫酸软骨素沉积，这是软骨基质形成的直接证据。阴性对照组则着色很弱。
3.7 Toll样受体表达
软骨分化后，WJ-MSCs的Toll样受体表达谱发生改变：TLR3和TLR4表达上调，而TLR5和TLR6表达显著下调，表明分化过程改变了细胞的先天免疫受体特征。
3.8 免疫调节细胞因子的表达
酶联免疫吸附测定分析显示，在（CHI-HA）10支架上经历自发软骨分化后，WJ-MSCs分泌的抗炎细胞因子IL-10和促炎细胞因子TNF-α水平均显著高于未分化的对照组。
结论与意义
这项研究系统性地证明，由壳聚糖和透明质酸通过逐层自组装构建的（CHI-HA）10聚电解质多层膜，能够为沃顿胶来源间充质干细胞提供一个理想的微环境，使其在无需添加外源性、昂贵且有潜在副作用的生长因子TGF-β的情况下，实现高效的自发软骨分化。这种分化不仅在细胞形态、基因转录和蛋白质合成水平上得到全面证实，还促进了功能性软骨基质（硫酸软骨素）的沉积。
更为重要的是，该研究揭示了这种材料诱导的软骨分化过程伴随着WJ-MSCs免疫调节功能的增强。分化后的细胞显著上调了抗炎细胞因子IL-10的分泌，并选择性调节了Toll样受体的表达谱（上调TLR3/TLR4，下调TLR5/TLR6）。这些变化共同塑造了一个有利于组织修复和抑制过度炎症的免疫微环境。其中TNF-α水平的升高被认为与TGF-β信号通路的交互调节有关，而非单纯的促炎反应。
综上所述，该研究不仅成功开发了一种“无生长因子”的软骨分化新策略，避免了传统方法对TGF-β的依赖及其相关弊端，还首次全面评估了在此过程中干细胞免疫调节特性的协同演化。这标志着软骨组织工程领域的一个重要进展：所构建的（CHI-HA）10多层膜支架不仅是一个被动的物理支撑结构，更是一个能主动提供生化与物理信号、同时驱动组织再生与免疫调节的“智能”平台。这项成果为未来开发更安全、更经济、功能更全面的软骨修复疗法奠定了坚实的实验基础，展现了巨大的临床转化潜力。
