《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Tissue maturation and development of mechanical properties in hyaluronic acid bioink-based cartilaginous constructs
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本研究针对软骨组织工程中生物制造构建体力学表征单一、基质-力学关联缺失的问题，采用间充质基质细胞（MSC）负载透明质酸（HA）基生物墨水，通过6周软骨分化时序分析，结合多模态力学测试揭示糖胺聚糖（GAG）与胶原含量分别提升57倍和52倍，驱动滞后能提升265倍、经典剪切模量达50 kPa，并建立基质预测模型，为仿生软骨再生提供力学设计范式。
关节软骨如同人体关节的“减震垫”，凭借其独特的多孔粘弹性特性，在运动中缓冲压力、减少摩擦。然而，一旦因运动损伤或骨关节炎导致软骨缺损，这种无血管组织极难自我修复。临床上现有的药物或手术疗法往往难以实现长期稳定的修复效果，而基于组织工程的再生策略又常面临构建体力学性能不足、易形成纤维软骨而非透明软骨的困境。更棘手的是，过去对3D生物打印软骨构建体的力学评估多局限于单一参数（如杨氏模量），缺乏对基质成分与复杂力学行为（如非线性、滞后、应力松弛）伴随发育过程的系统性关联分析。在此背景下，一项发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的研究聚焦于透明质酸（HA）基生物墨水构建的软骨组织，深入探究了其从细胞负载到成熟过程中的组织成熟规律与力学性能演变机制。
研究人员采用人源间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSC）作为种子细胞，将其嵌入低浓度（总聚合物含量2%）的硫醇化透明质酸（HA-SH）生物墨水中。通过光交联技术制备成直径5 mm、高2 mm的圆柱形构建体后，在软骨诱导分化培养基中进行为期42天的培养。研究采用了多时间点（第1、3、7、14、21、42天）的时序分析策略，结合了生化定量（DNA、糖胺聚糖GAG、羟脯氨酸/胶原含量）、组织学染色（番红O、天狼星红、免疫组化）以及微观结构观察（冷冻扫描电镜Cryo-SEM）。在力学表征方面，研究并未止步于常规的小变形测试，而是利用流变仪在模拟生理载荷条件下进行了大变形多模态力学测试，涵盖压缩（最高20%应变）与拉伸（最高2.5%应变）的循环加载以及应力松弛实验。此外，为了验证基质与力学的因果关系，研究还引入了脯氨酰4-羟化酶（Prolyl 4-Hydroxylase, P4H）抑制剂乙基-3,4-二羟基苯甲酸酯（EDHB）来特异性阻断胶原合成，从而观察力学响应的变化。
3.1 ECM development
研究发现，随着分化时间延长，构建体内的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）显著积累。组织学和生化定量分析显示，糖胺聚糖（GAG）和胶原（Collagen）的含量从第1天到第42天分别增加了57倍和52倍。免疫组化结果显示，II型胶原和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的表达逐渐增强，至第21天和42天实现了基质的均匀分布。值得注意的是，第42天时检测到了一定程度的X型胶原表达，提示存在软骨细胞肥大现象。微观结构分析发现，含细胞的构建体孔隙率随时间下降，而无细胞对照组则保持稳定，这进一步证实了ECM沉积对支架结构的重塑作用。
3.2 Influence of the ECM development on the mechanical properties of cartilaginous constructs
ECM的积累深刻改变了构建体的宏观力学响应。3.2.1 Stress relaxation behavior in compression显示，早期（第1-7天）样品在压缩保持300秒后，归一化名义应力仍维持在较高水平（约0.33-0.39），而晚期（第21-42天）样品的应力松弛速度显著加快，最终降至0.09-0.15，更接近天然软骨的平衡态特征。3.2.2 Cyclic loading behavior in compression and tension and corresponding material parameters表明，随着时间推移，构建体在循环加载中表现出更显著的滞后（Hysteresis）现象，整体提升了265倍，且非线性行为更加明显。最大名义应力在压缩和拉伸模式下分别达到151 kPa和7 kPa。通过拟合修正的单项和双项Ogden超弹性模型发现，经典剪切模量（Classical Shear Modulus, μ）从第1天到第42天增长了174倍，最终达到50.2 kPa（对应表观杨氏模量约150.6 kPa）。
3.3 Correlation between cartilaginous ECM and mechanics
相关性分析揭示了基质与力学的强关联。GAG和胶原总量与滞后行为呈极强的线性正相关（R2> 0.96），与经典剪切模量也呈现极高的线性相关性（未调节响应R2> 0.995）。此外，基质含量与非线性参数α呈对数相关。这表明ECM不仅是构建体的结构填充物，更是决定其粘弹性力学行为的核心因素。
3.4 Inhibition of collagen production by prolyl 4-hydroxylase inhibitor
为了验证胶原的具体贡献，研究使用了P4H抑制剂EDHB。结果显示，抑制组的胶原含量在第14天和第42天分别降至未抑制组的44%和9%。力学测试表明，抑制组的应力松弛行为虽仍随时间改善，但其最大名义应力和剪切模量显著低于对照组，相对值在第42天仅为0.1左右。然而，即便在胶原合成受阻的情况下，胶原含量与剪切模量及滞后行为依然保持着强线性关系（R2= 0.93-0.97），这证实了胶原对于维持构建体刚度具有不可替代的作用。
3.5 ECM-based prediction of mechanical properties
基于上述强相关性，研究团队建立了一个基于基质的力学预测函数：μ(COL) = 0.18 × COL + 0.247。该函数能够仅通过测定构建体中的胶原含量（μg）来高精度预测其经典剪切模量（R2= 0.99），这一模型整合了未抑制和抑制两组数据，具有良好的鲁棒性。
该研究的重要意义在于，它不仅详细描绘了无支架支撑的HA基生物墨水构建体在6周培养期内的ECM成熟轨迹与复杂的粘弹性力学演变规律，更重要的是建立了基质组分（特别是胶原和GAG）与大变形力学参数（剪切模量、滞后、应力松弛）之间的定量联系。研究证实，对于允许均一基质分布的生物墨水体系，ECM的积累是构建体获得类似天然软骨力学行为的关键驱动力。提出的基质-力学预测函数，为未来通过调控生物墨水配方或分化条件来精准设计工程化软骨的力学性能提供了理论依据和计算工具。尽管构建体的绝对力学强度仍低于天然软骨，且静态培养可能限制了进一步的力学提升，但这项工作强调了超越单一杨氏模量的多模态力学表征的重要性，为下一代高性能仿生软骨植入物的开发奠定了坚实基础。
