《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Metabolic bottleneck at TCA cycle entry point and competition with trehalose production hinder growth of methylotrophic yeasts during methanol assimilation
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甲基酵母甲醇代谢中TCA循环及氨基酸合成是生长限制因素，补充氨基酸或敲除trehalose合成基因可显著提升生长效率和生物量。
神山绫也 | 清家泰辅 | 冈桥信之 | 卡哈尔·普里哈迪 | 小柿千秋 | 松田文雄
大阪大学信息科学与技术研究生院生物信息工程系，日本大阪市 Suita 区 Yamadaoka 1-5，邮编 565-0871
甲基营养型酵母是用于从甲醇中进行生物生产的有前景的宿主，但在甲醇存在的情况下，它们的生长会受到显著抑制。在这项研究中，我们通过比较代谢组分析，研究了 Komagataella phaffii、Ogataea polymorpha 和 Candida boidinii 在甲醇吸收过程中的代谢瓶颈。我们发现，在所有三种酵母中，甲醇吸收过程中 α-酮戊二酸衍生的氨基酸和三羧酸（TCA）循环中间体都出现了共同减少的现象，这表明 TCA 循环的入口处存在代谢瓶颈。此外，K. phaffii 和 O. polymorpha 在甲醇存在时会积累海藻糖。ΔΔG 分析表明，丙酮酸激酶和 TCA 循环入口酶的活性降低可能是限制步骤。TCA 循环衍生的氨基酸（包括 Glu、Arg 和 Pro）的生物合成是一个限制因素，因为补充这些氨基酸显著提高了所有三种酵母的生长速率和最终细胞密度。进一步地，破坏 K. phaffii 中的海藻糖生物合成基因（TPS2）后，生长得到了进一步改善，这表明海藻糖的积累对基于甲醇的生长有负面影响。在 K. phaffii 中破坏 TPS2 后补充氨基酸，使特定生长速率提高了 1.2 倍，最终细胞密度提高了 2.73 倍。这些发现揭示了甲醇存在时甲基营养型酵母生长的代谢限制，并为提高生物生产效率提供了策略。
部分内容摘录
菌株和培养条件
本研究使用了三种甲基营养型酵母：K. phaffii CBS7435、O. polymorpha NBRC1476 和 C. boidinii NBRC10871（日本工业技术综合研究所 NITE）。所有培养均使用 BioShaker（GBR-20，TAITEC，埼玉县）在轨道摇床模式下进行。甘油保存的酵母细胞被划线接种在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上（10 g L?1 Bacto 酵母提取物，20 g L?1 Bacto 蛋白胨，20 g L?1 葡萄糖，20 g L?1 琼脂），然后进行静态培养
三种甲基营养型酵母吸收葡萄糖和甲醇的培养特性
K. phaffii 在含有 20 g L?1 葡萄糖作为碳源的合成培养基（SD 培养基）中在好氧条件下进行批量培养（图 1、S2 和 S3，以及表 S6）。选择这种合成培养基是因为在分析代谢组数据时无需考虑其他碳源或成分。对数期的特定生长速率为 0.28 ± 0.01 h?1，特定葡萄糖消耗率为 5.2 ± 0.5 mmol (gDCW h)?1。
讨论
在这项研究中，我们对三种甲基营养型酵母 K. phaffii、O. polymorpha 和 C. boidinii 进行了比较代谢组分析，以研究甲醇吸收过程中的代谢瓶颈。与使用葡萄糖相比，当使用甲醇作为碳源时，这些酵母的特定生长速率显著下降（图 1）。此外，在较高甲醇浓度下也观察到了特定生长速率的下降（图 1）。
CRediT 作者贡献声明
神山绫也：撰写 – 原初草稿、验证、研究。清家泰辅：研究。冈桥信之：撰写 – 原初草稿、验证、方法学、研究。卡哈尔·普里哈迪：撰写 – 审稿与编辑、概念化。小柿千秋：撰写 – 审稿与编辑。松田文雄：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念化。
致谢
我们感谢岐阜大学的中川智之教授对本研究提供的有益意见。同时感谢岛津公司的王秋毅博士、伊藤由纪博士和井田纯子博士在 LC-MS 分析方面提供的技术支持。本研究部分得到了日本政府的 科学研究资助（B 类）（项目编号：22H01879）和 JST CREST（项目编号：JPMJCR21N2）的支持。
