γ-稻醇和二丁基邻苯二甲酸酯在米曲霉脂肪酶作用下的酶促降解

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Enzymatic degradation of γ-oryzanol and dibutyl phthalate by Aspergillus oryzae lipase

本研究克隆并表达了Aspergillus oryzae的lipO745基因，去除23个氨基酸的N端信号肽，在毕赤酵母中成功异源表达，获得分泌型活性酶rLipO745Δ23。其分子量约65 kDa，对pNP-C4底物特异性高（369.2±6.6 nmol/mL·mg?1），催化DBP转化为MBP（7.24±0.61 nmol/mL·mg?1），并水解γ-oryzanol衍生物如cycloartenyl ferulate，β-sitosterol不抑制活性，显示其作为生物催化剂的潜力。

　　

佐藤春奈 | 市川京太郎 | 篇野良仁 | 小关卓也

山形大学农学部，日本鹤冈市若叶町1-23，997-8555

邻苯二甲酸酯作为塑料制造中的增塑剂被广泛使用，以其干扰内分泌系统的特性而闻名。γ-稻醇衍生物是一种由甾醇和阿魏酸酯组成的功能性脂质，具有多种生物活性。在本研究中，我们从Aspergillus oryzae RIB40中克隆并异源表达了编码脂肪酶的基因（lipO745），通过pPICZαC载体将其删除了23个氨基酸的N端信号肽后，在Pichia pastoris中进行了表达。所得重组酶（rLipO745Δ23）能够成功分泌为具有活性的细胞外蛋白。纯化的重组脂肪酶的分子量约为65 kDa（通过SDS–PAGE测定）。使用

-硝基苯基（pNP）酯（C2–C16）进行的底物特异性实验表明，pNP丁酸酯（pNP–C4）的水解效率最高，其比活性为369.2 ± 6.6 nmol·mL^?1 mg^?1。rLipO745Δ23能够将二丁基邻苯二甲酸酯（DBP）转化为单丁基邻苯二甲酸酯（MBP），而不会进一步降解为邻苯二甲酸，其对DBP的比活性为7.24 ± 0.61 nmol·mL^?1 mg^?1。动力学参数（K_m和k_cat）分别为：pNP–C4底物时为0.66 ± 0.1 mM和37.8 ± 6.4 s^?1；DBP底物时为0.40 ± 0.05 mM和1.30 ± 0.23 s^?1。此外，rLipO745Δ23对γ-稻醇也表现出可检测的水解活性，其中包括阿魏酸与三萜醇的结合物环阿魏酰酯。值得注意的是，β-谷甾醇（γ-稻醇的主要水解产物）并未抑制酶的活性。这些发现凸显了rLipO745Δ23作为环境和工业应用中催化邻苯二甲酸酯及γ-稻醇衍生物降解的多功能生物催化剂的潜力。

部分内容摘录

化学品和试剂

以下

-硝基苯基（pNP）酯购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）：pNP乙酸酯（pNP–C2）、pNP丁酸酯（pNP–C4）、pNP己酸酯（pNP–C6）、pNP辛酸酯（pNP–C10）、pNP十二酸酯（pNP–C12）和pNP棕榈酸酯（pNP–C16）。邻苯二甲酸酯衍生物（包括单丁基邻苯二甲酸酯MBP和DBP）、γ-稻醇、环阿魏酰酯以及β-谷甾醇购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。甲基阿魏酸酯（MFA）购自Apin Chemicals

rLipO745Δ23的纯化及其对pNP酯的底物特异性

从Aspergillus oryzae中克隆的编码脂肪酶基因lipO745（去除了23个氨基酸的信号肽）被插入P. pastoris表达载体pPICZαC中，并成功表达为具有活性的细胞外酶。分泌到培养基中的重组蛋白rLipO745Δ23的活性与rLipO745相同。通过SDS–PAGE测定，rLipO745Δ23的分子量约为65 kDa（图1A）。该酶通过两步纯化程序进行提纯

讨论

随着结构和功能数据的不断丰富，脂肪酶的分类经历了多次修订。在已鉴定的蛋白质中，LipO745与M. cinnamomea的脂肪酶（McLipB；66%）、M. albomyces的甾醇酯酶（STE1；62%）、O. piceae的甾醇酯酶（OPE；58%）以及C. rugosa的脂肪酶（LIP3；44%）具有较高的序列相似性。使用AlphaFold3（https://alphafoldserver.com）将LipO745的三维模型与LIP3晶体进行叠加

CRediT作者贡献声明

佐藤春奈：撰写——初稿。市川京太郎：研究。篇野良仁：撰写——审阅与编辑。小关卓也：撰写——审阅与编辑。

致谢

本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的特定资助。