在假单胞菌（Pseudomonas putida）细胞工厂中，无需诱导剂即可实现黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）的构成性生产

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Constitutive and inducer-free production of xanthine oxidase in a Pseudomonas putida cell factory

通过构建低拷贝质粒pPegP119并表达完整xodCBA基因簇，在假单胞菌KT2440中实现了重组黄嘌呤氧化酶（XOD）的高效生产，酶活性达5.6 U/mL，证实XodC对酶成熟至关重要。该酶最适pH 7.0、50°C，对Cu2?、Hg2?、Zn2?敏感。

　　

郭晓燕|郭雪莹|高媛|金海波|王建军

北京石油化工技术学院新材料与化学工程学院，中国北京市大兴区清源北路19号，邮编102617

在Pseudomonas putida KT2440中开发了一种稳健的异源表达系统，用于生产来自Cellulosimicrobium sp. TH20的重组黄嘌呤氧化酶（XOD）。为了减轻代谢负担并实现无需诱导剂的表达，通过将pUCP18的起源替换为低拷贝数的pSC101起源，构建了一个组成型表达质粒pPegP119。对两个基因簇的表达产物进行评估后发现，完整的xodCBA基因簇产生的活性（CsXodCBA，5.6 U/mL）显著高于截短的xodBA基因簇（CsXodBA，2.1 U/mL），这直接支持了XodC在酶成熟中的作用。这一作用通过生化实验得到了进一步证实：纯化的CsXodCBA中的钼含量约为CsXodBA的2.6倍，并且表现出显著更高的比活性（28.1 U/mg对比15.3 U/mg）。尽管存在基因差异，但最终组装的CsXodCBA和CsXodBA形式相同，仅由XODA（106 kDa）和XODB（30 kDa）亚基组成。纯化的CsXodCBA的生化特性显示其在pH 7.0和50 °C下的活性最佳，动力学参数为K_m = 85 ± 4 μM和V_max = 20.6 ± 1.3 μM min^?1。该酶的活性受到Cu²⁺、Hg²⁺和Zn²⁺的强烈抑制。因此，通过这项工作建立了一个高效且成本效益高的活性XOD生产平台。

章节摘录

菌株、质粒和培养条件

我们的实验室保存了P. putida KT2440和E. coli JM109菌株，以及pUC18和pUCP18（21）质粒。E. coli JM109在37 °C的Luria–Bertani（LB）培养基中培养，用于基因克隆和表达实验。

化学品和试剂

黄嘌呤、尿酸和草酸购自Acros（北京，中国）。其他所有化学品均为分析级，来自商业渠道。DNA和蛋白质分子量标记物购自Transgen Biotechnology Co.

对Cellulosimicrobium sp. TH-20中XOD基因簇的分析

Cellulosimicrobium sp. TH-20中的XOD基因簇包含三个基因：xodC、xodB和xodA。由xodB编码的小亚基（31 kDa）含有FAD结合域，而由xodA编码的大亚基（106 kDa）含有两个[2Fe–2S]簇结合域和一个MPT结合域，酶的活性中心也位于该亚基中。xodC编码的XODC亚基（43 kDa）的功能尚未明确，但据推测它可能有助于酶的组装过程。

讨论

最初，对xodCBA或xodBA基因簇进行了密码子优化，并克隆到各种表达载体（pET30a、pGEX和pMAL系列）中，以便在E. coli中异源表达。尽管SDS-PAGE分析证实某些构建体产生了可溶性蛋白质，但在相应的细胞裂解物中未检测到酶活性。这一结果与先前的报告一致，即E. coli缺乏组装活性CsXOD所需的特定翻译后机制（1）。

CRediT作者贡献声明

郭晓燕：研究工作。郭雪莹：研究工作。高媛：资源提供。金海波：数据分析。王建军：方法学设计及概念构思。

致谢

我们非常感谢北京市教育委员会的科学研究计划（KM202110017009，授予郭晓燕）提供的财政支持。