《Comprehensive Physiology》：Look Who Is Talking: Extracellular Vesicles as Mediators of Intercellular and Interorgan Communication
ABSTRACT
细胞外囊泡（EVs）由所有器官产生，充当通讯载体。它们在体内循环，靶向邻近及远端细胞与器官，驱动下游信号传导。EVs不仅是组织微环境中细胞间通讯的效应器，在维持稳态、应对刺激及驱动下游生物学过程中也至关重要。新兴研究方法揭示了EV介导的长距离通讯在维持机体稳态及指示病理状态方面的全新功能。本综述提供了关于EVs作为细胞间和器官间通讯介导者的最新进展。
1 Introduction
在复杂的多细胞生物中，器官间的相互作用与协作是发育、维持和修复所必需的。对刺激的反应、稳态的维持和适应是机体正常功能的基础，这依赖于短距离（同一微环境中的细胞间）和长距离（不同器官间）精细的细胞间对话。这种信号不仅在生理条件和衰老中至关重要，在代谢综合征、自身免疫病、痴呆和癌症等病理条件下也同样关键，此时器官会相互通讯以发出正常功能改变的信号。这种细胞间和器官间通讯由内分泌或旁分泌因子，以及供体细胞释放的EVs介导。EVs是由所有细胞分泌的膜包被囊泡，普遍存在于细胞外环境中。EVs于20世纪60年代首次被发现，80年代得到更明确描述。Aaronson及其同事提出了“细胞外囊泡”这一术语，指带有脂质双分子膜的囊泡，这促使2011年该术语的正式使用和国际细胞外囊泡学会的成立。EVs最初被认为是细胞清除多余物质的载体，但大量研究已确定其在细胞间和器官间通讯中扮演着更关键的角色。EVs由每个细胞组成型释放，其内容物通常反映了供体细胞的状态。Valadi及其同事提出了一种新的细胞间遗传交换机制，他们发现mRNA和microRNA（miRs/miRNAs）被包装进供体细胞的EVs中并递送至另一个细胞，这些RNA具有完全功能并能调控新位置的生物学过程。在更系统的层面上，一旦进入循环，这些囊泡有可能到达并靶向任何器官，并运输包括核酸、蛋白质和多种代谢物在内的各种货物，强调了它们在器官间通讯中的作用。
根据其生物发生，EVs主要分为外泌体（小于200 nm）、ectosomes（100–1000 nm）和凋亡小体（50–5000 nm）。由于尺寸重叠，区分具有挑战性，因此也可分为小型EVs（通常小于200 nm）和大型EVs。特定的表面标志物（如ALG-interacting protein X、TSG101和四跨膜蛋白CD9、CD63、CD81）曾被推荐作为外泌体标志物，但其存在并非外泌体特异，也出现在其他EVs中。迄今为止，也没有通用的EVs或其亚型的分子标志物。根据最新的EV研究最小信息（MISEV）指南，最准确的区分是基于生物发生，除非能证明其生物发生，否则不建议区分不同类型的EVs。鉴于目前技术在明确分离和表征纯外泌体方面存在局限性，本综述采用更广泛的术语“细胞外囊泡（EVs）”。
EV的内容物受其亚型、起源细胞和生理条件驱动。多个公开数据库（Exocarta、Vesiclepedia和EVpedia）汇集了数百项研究的数据。这些囊泡可以递送其内容物，有效改变靶细胞在生理和病理条件下的生物学反应，从而参与维持稳态、生殖功能、衰老和疾病反应。值得注意的是，EVs可以穿过血脑屏障（B&B）和母胎屏障，并可被人工改造以递送治疗性货物，如化疗药物、shRNA和免疫调节剂。此外，鉴于其在所有生物体液中被鉴定出来，它们可能作为诊断、预后和治疗性生物标志物。
本综述将重点关注EVs作为生物通讯介导者的角色，从细胞间相互作用到不同器官间的长距离通讯提供一个概览。
2 Biology of Extracellular Vesicles
细胞可产生多种基于生物发生分类的EVs。此处总结了外泌体、ectosomes和凋亡小体的生物发生及摄取机制。
2.1 Exosomes Biogenesis
外泌体生物发生和释放包含一系列协调步骤：货物选择并招募至多囊泡体（MVB）、MVB成熟、MVB转运至质膜，以及MVB与质膜融合释放外泌体。形成腔内囊泡（ILVs）的主要机制是转运所需的内体分选复合物（ESCRT）途径，但也描述了其他不依赖ESCRT的途径。将生物分子（如脂质、蛋白质、DNA和RNA）分选进入外泌体依赖于ESCRT依赖或不依赖的途径。
2.1.1 ESCRT Dependent Pathways
ESCRT复合物包含五个核心复合物，逐步协作：ESCRT-0、I、II、III和液泡蛋白分选4（VPS4）。ESCRT机制始于ESCRT-0与泛素化蛋白结合。随后ESCRT-0结合内体上的磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）以捕获货物。ESCRT-I和ESCRT-II被招募到复合物中，形成鞍形复合物以促进ESCRT-III的组装。ESCRT-III通过VPS4的ATP水解提供的能量在复合物中聚合，促进膜变形和出芽，形成ILVs。ESCRT复合物也可以将去泛素化酶招募到ILVs，但这并非所有货物蛋白的必要条件。
其他几种蛋白质可以招募并启动ESCRT途径以形成ILVs。Alix被充分描述为可招募并成核ESCRT-III。Syndecan-Syntenin-Alix途径可以通过识别货物（如成纤维细胞生长因子受体FGFR和赖氨酰-tRNA合成酶）来形成ILVs。整合素可以直接招募ESCRT-0，进而招募HD-PTP。HD-PTP招募ESCRT-III和VPS4以形成ILVs。这些ILVs被储存并送往溶酶体降解。ESCRT-I的组分Tsg101可以识别半乳糖凝集素-3和BAG6以启动ESCRT依赖途径。
蛋白质通过单泛素化并被ESCRT-0识别分选进入外泌体。RNA则通过RNA结合蛋白的序列识别加载到外泌体中。几类RNA，包括mRNA、非编码RNA（ncRNAs）、miRNA和环状RNA（circRNAs）都可能作为外泌体中的货物。miRNA是外泌体中描述最充分的货物；RNA结合蛋白hnRNPAB1将miRNA加载到外泌体中。研究发现miRNA具有一个共同的基序序列，hnRNPA2B1可以识别并分选miRNA。RNA诱导的沉默复合物组分Ago2被报道分选进入外泌体，并负责分选特定的miRNA，包括let-7a、miR-100和miR-320a。有趣的是，RNA修饰N6-甲基腺苷被报道抑制AGO2/miRNA相互作用并促进hnRNPA2B1的识别，从而促进miRNA加载到外泌体。
2.1.2 ESCRT Independent Pathways
MVB膜的脂质组成和相关蛋白驱动不依赖ESCRT的ILV形成。鞘脂、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、膜蛋白和神经酰胺形成类似脂筏的结构，并诱导MVB出芽形成ILVs。中性鞘磷脂酶2（nSMase2）将鞘磷脂转化为神经酰胺；神经酰胺可以诱导出芽并形成ILVs。敲低nSMase2会减少特定货物的ILVs。EFGR可以磷酸化RAB31以促进RAB31与脂筏中的flotillin蛋白相互作用，并驱动EFGR进入ILVs。四跨膜蛋白如TSPN6和CD63可以分选并促进ILV形成。溶酶体相关膜蛋白2，亚型A（LAMP2A）通过与CD63、Alix、Syntenin-1和RAB31的相互作用，将具有KFERQ样基序的蛋白质分选进入外泌体。
外泌体携带的脂质货物要么位于外泌体内部，要么位于外膜。如前所述，外泌体膜可携带胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸。例如，肝细胞释放富含神经酰胺的外泌体，诱导促炎反应。脂肪细胞分泌充满脂质的EVs，被巨噬细胞摄取。膜脂质的分布因外泌体而异。例如，磷脂酰丝氨酸通常位于外泌体内膜，在凋亡或恶性细胞中外翻以促进巨噬细胞对其的摄取。
MVBs通过细胞骨架、肌动蛋白和微管的相互作用转运至质膜。肌动蛋白结合蛋白Cortactin指导转运和停靠至质膜。一旦靠近质膜，Rab GTP酶家族成员、SNARE复合物和拴系蛋白有助于MVBs的融合。Rab27a、Rab27b和Rab35将特异性拴系蛋白招募至MVB中的V-SNARE和质膜中的T-SNARE。一旦MVB停靠并与质膜融合，外泌体即被释放。
2.2 Ectosomes Biogenesis
Ectosomes起源于质膜的外向出芽，由膜脂质和细胞骨架蛋白的重排决定。简而言之，质膜的改变、脂质成分和膜不稳定性驱动微域的形成，出芽将在这些区域发生。蛋白质、核酸、脂质和代谢物被分选并招募到出芽位点。一旦ectosome的出芽形成，在某些情况下ESCRT-III执行剪切，ectosome被释放到细胞外空间。几种机制驱动这些生物物理变形，包括与外泌体共享的机制，如ESCRT蛋白。 arrestin结构域包含蛋白1（ARRDC）可以招募并将ESCRT-I蛋白TSG101定位到质膜，在那里驱动出芽和ectosome形成。细胞刺激可增加Ca2+浓度并招募钙依赖性酶，这些酶与翻转酶和floppases活性的改变一起，改变膜组成以促进出芽。
2.3 Apoptotic Bodies Biogenesis
凋亡小体是在凋亡细胞受调控的解体过程中产生的。此类囊泡的大小和货物差异很大，因为它们含有线粒体、网状结构和细胞核碎片。凋亡小体的形成是通过质膜出芽形成不同大小的囊泡发生的。这一过程由Rho相关卷曲螺旋包含蛋白激酶1（ROCK1）诱导，该激酶在凋亡级联反应中被切割的caspase 3激活。ROCK1激活肌球蛋白轻链（MLC）并驱动肌动球蛋白收缩性。膜起泡最初类似于允许细胞迁移的突起形成，随后生长并脱离形成凋亡小体。凋亡细胞将磷脂酰丝氨酸从内膜翻转到外膜，诱导巨噬细胞的“吃我”信号。
2.4 EV Uptake
亲代细胞分泌的EVs可以通过三种不同的机制与受体细胞相互作用：
(1) 与质膜融合：EVs的脂质双分子层与质膜的脂质双分子层融合，允许EV内容物直接释放到受体细胞内。SNAREs和Rab蛋白家族、整合素、粘附分子和脂筏样结构域介导此过程。
(2) 直接接触：EVs可以通过表面受体直接接触触发受体细胞中的信号级联。参与免疫调节和凋亡功能的EVs通常在表面表达分子，与受体细胞质膜上的受体相互作用，诱导其激活。
(3) 内化：EVs被受体细胞内化，在那里它们与细胞内区室融合以释放后续货物。内化可以通过多种方式发生，包括内吞作用、吞噬作用或大胞饮作用。在网格蛋白介导的内吞作用中，各种跨膜受体和配体在质膜上组装以创建内吞位点。货物被招募到该位点，膜成形为内陷，然后从质膜分离。囊泡最终脱壳并与内体融合。类似地，小窝蛋白（Caveolins）作为整合膜蛋白，形成小的、有被膜的膜内陷，促进EVs的小窝蛋白介导的内吞。内吞作用也可以通过脂筏介导，脂筏是质膜中富含胆固醇和鞘脂的部分，促进EVs内化。在EVs吞噬过程中，细胞膜变形并包围细胞外颗粒，形成吞噬体，将其货物导向溶酶体。大胞饮通过片状伪足创建向内的质膜内陷，这些内陷塌陷回质膜形成细胞内区室，称为巨饮体。这些巨饮体随后与晚期内体或溶酶体融合。
3 EV-Mediated Communication
3.1 Cell-To-Cell Communication
细胞间通讯是响应应激或自然条件刺激以及确保维持稳态的基本生物学特征。EVs存在于许多体液（血液、羊水、尿液、乳汁和脑脊液）中且稳定。EVs的一个核心作用是介导细胞间通讯，通过将分子货物在细胞间转移，实现局部和长距离的通讯。虽然几乎所有细胞类型都可以释放EVs，但某些细胞由于其细胞间通讯的作用（主要涉及免疫反应、内分泌通讯和组织维持）而被认为释放更多的EVs。其中包括免疫细胞（树突状细胞、T细胞和巨噬细胞）来源的EVs可以调节免疫反应、促进免疫细胞间通讯和影响炎症。除了免疫细胞，肿瘤细胞也释放大量的EVs，促进细胞间相互作用，影响肿瘤进展、转移和免疫逃逸。干细胞来源的EVs富含蛋白质、脂质和RNA，在组织再生和修复中起重要作用。此外，血小板来源的EVs已被证明可诱导凝血、伤口愈合以及血小板与其他细胞类型之间的通讯。血管内皮细胞释放EVs以维持血管稳态并调节其环境中的免疫细胞招募。最后，神经元和神经胶质细胞释放EVs，在神经退行性疾病和大脑内的细胞间通讯中发挥作用。
总体而言，EVs的功能多样性反映了其细胞起源的特殊作用，突出了它们在生理和病理过程中的重要性。所有细胞都是EV信号的潜在靶点。然而，它们对EV信号作出反应的能力取决于是否存在特异性受体和/或能够与EVs携带的生物活性分子相互作用的活性通路。EVs中的蛋白质、脂质和RNA都可与靶细胞相互作用，影响各种细胞过程，如(1)信号转导，(2)基因调控，和(3)免疫调节。
通过递送其内容物，EVs可以以有益或有害的方式影响受体细胞生物学。它们是短程和长程过程（如免疫系统调节、神经系统和内分泌信号传导、组织稳态和修复、神经元通讯、代谢和激素调节以及癌症监测和预防）中介导细胞间通讯的最重要介质。这种在细胞间通讯中的重要作用使其参与多种疾病状态，包括心血管疾病、糖尿病、朊病毒传播、炎症、病毒感染和肿瘤发生。本节重点关注发生在单个组织或内分泌微环境中的EV介导的通讯，其中EV产生细胞和EV接收细胞均位于局部；讨论由免疫细胞、间充质细胞、肿瘤和内分泌细胞释放的EV介导的最相关的细胞间信号传导。许多这些信号涉及EV封装的miRNA的转运。
3.1.1 Immune Cell-Derived EVs
免疫细胞来源的EVs代表了基于旁分泌和自分泌形式介导细胞间通讯的最佳范例，为免疫细胞功能创造了最佳微环境。具有免疫调节功能的蛋白质（MHC-I、MHC-II、共刺激蛋白CD86和粘附蛋白CD11b、CD54/ICAM）可以在EVs中富集。一些同时携带MHC-I和MHC-II复合物的EVs是启动T细胞所必需的，并且可以激活T淋巴细胞上的T细胞受体（TCR）。有趣的是，功能性MHC-抗原肽复合物的存在可能支持EV介导的适应性免疫反应的启动。
树突状细胞（DC）可以根据微环境释放几种亚型的EVs。树突状细胞来源的EVs（DCEVs）可以通过激活特异性T细胞来激活先天免疫系统。含有miR-155的DCEVs可以影响T细胞反应并参与抗原呈递。当在耐受原性环境中激活时，DCs可以产生IL-10并在表面表达Fas配体；在这种情况下，DCEVs可以抑制自身免疫反应。DCEVs是独特的，已被研究作为许多疾病（如癌症免疫疗法和招募间充质干细胞MSCs进行组织修复）的潜在治疗手段。
巨噬细胞来源的EVs（MDEVs）的蛋白质组成在激活后发生变化；NOD样受体（NLR）相关蛋白、细胞因子和趋化因子（如IL-17、CXCL10、TNF-α、CCL3和CXCL2）水平升高。相反，负调控ICAM的miR-17减少。此外，活化的巨噬细胞可以释放EVs，通过激活TNF相关信号通路、NLRP3受体依赖性炎症小体和TOLL样受体（TLR）诱导炎症反应。MDEVs携带的miR-155可以减少心脏成纤维细胞中的细胞增殖并增加炎症。其靶基因SOS1是Ras激活的主要调节因子。此外，活化的MDEVs还可以在高血压条件下增加肝细胞中的炎症，导致急性肝损伤，并在血管内皮细胞中增加炎症。最后，MDEVs通过失调整合素β1和αMβ2整合素，可以抑制肝细胞癌（HCC）中的内皮细胞和肿瘤细胞迁移。
自然杀伤（NK）细胞不断产生EVs。NK激活的EVs可以触发静止NK的激活；有趣的是，Fas-L（膜结合和可溶形式）存在于所有NK来源的EVs中，但在激活的EVs中更重（50 kD而非40 kD）。NK激活的EVs中的Fas-L和穿孔素诱导肿瘤细胞凋亡。NK EVs对抗激活的免疫细胞。通过这种方式，它们有助于维持免疫反应的稳态。最后，肿瘤细胞通过大胞饮摄取这些EVs可以阻断NK细胞溶解活性，阻断其表面的CD226。
活化的T细胞EVs（TCEVs）可以增加静止自体细胞的增殖。它们的货物富含miRNAs，转移这些小RNA可以增强APC的抗原呈递能力。MiR-150是淋巴细胞的关键抑制因子，已显示流感疫苗接种激活的淋巴细胞可以降低其水平，将其释放到EVs中。黑色素瘤细胞中的ERK和NF-KB通路被CD8+ TCEVs激活，从而增加其转移行为。TCEVs可以模拟CAR-T细胞受体特性，有人提出将其用于治疗用途以避免CAR-T细胞细胞因子释放综合征（CRS）。优势主要有三：(1) 它们可以将颗粒酶和溶酶体酶直接转移到靶标，无需穿孔素。(2) 它们的小尺寸允许它们穿过血脑屏障和肿瘤形成屏障，直接到达细胞。(3) 抗肿瘤药物可以装载到这些EVs中。
3.1.2 Mesenchymal Stem Cells-Derived EVs
EV介导的短距离通讯的另一个生理作用是驱动组织稳态和伤口愈合。体细胞干活性的精确和准确调节对于维持组织稳态是必要的。这些细胞必须对组织损伤做出反应，并根据组织需求增殖，同时避免过度增殖。组织损伤通常以组织酸中毒为特征，研究表明EVs的摄取依赖于细胞内和微环境的酸度，因此受损组织细胞更容易内吞EVs。间充质干细胞（MSCs）是许多成人组织中的基质干细胞。它们可以分化为所有胚胎谱系（外胚层、中胚层和内胚层），在组织稳态以及伤口修复和组织再生中发挥重要作用。MSCs是成人组织中分泌EV最多的细胞系之一。用药物吡格列酮预处理MSCs后分泌的EVs可以诱导血管生成，激活Akt和eNOS水平，并支持伤口愈合。脂肪MSCs EVs中释放的长非编码RNA（lncRNA）H19可以下调miR-19b并上调其靶标SOX9，进而激活Wnt/β-Catenin通路，增强成纤维细胞迁移和增殖，加速皮肤伤口愈合。MSCs可以调节适应性和先天性免疫细胞。有证据表明，MSCs主要通过旁分泌途径（主要是EVs）发挥其免疫调节作用。分泌的MSC EVs含有脂质、蛋白质和RNA，可以改变邻近细胞的行为。富含特定miRNA的MSC来源EVs可以进一步增强受体细胞固有的预防凋亡、促进血管生成和诱导心肌细胞增殖的能力。例如，MSC EVs中常见的miRNAs（如miR-21、miR-146a和miR-126）已被证实参与这些过程。许多研究者还报告说，MSC来源的EVs含有细胞因子和生长因子，如TGF-β1、IL-6、IL-10和HGF，这对于促进血管生成和组织修复至关重要。在临床前模型中，MSC来源的EVs已显示出超越伤口愈合的治疗潜力。在来曲唑诱导的多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型中，注射MSC EVs逆转了关键的病理特征，包括生育能力受损、激素失衡和卵巢组织病理学，说明了它们的再生和免疫调节能力。
3.1.3 Tumor Microenvironment-Derived EVs
EV介导的细胞间通讯对于癌症发展过程中微环境的重塑和转移前生态位的形成至关重要。肿瘤来源的EVs可以诱导自分泌/旁分泌致癌作用，促进血管生成，调节免疫系统，同时对基质细胞进行重编程。它们可以抑制细胞增殖和抗癌溶细胞功能，并消除单核细胞向树突状细胞的分化。此外，肿瘤EVs中的TGF-β1可以以自分泌方式激活增殖。研究人员已经证明，肿瘤微环境中存在的一些代谢物可以通过旁分泌途径，通常被包装在癌症相关成纤维细胞（CAF）EVs中，并将正常的CAFs转化为癌变状态。Let-7发挥战略性肿瘤抑制作用，癌细胞可以释放包装在EVs中的let-7以促进肿瘤发生。腺癌肿瘤细胞系中的miR-124a可以通过靶向Rab27a和Rab-32调节EV释放，从而调节转移过程。如前所述，含有KFERQ基序的蛋白质通过膜蛋白LAMP
