单层稀土荧光探针具有强烈的上转换发射特性，可用于全血中铁蛋白的高灵敏度侧向流动免疫分析检测

《Journal of Luminescence》：Single-layer rare earth fluorescent probes with strong upconversion emission for high-sensitivity lateral flow immunoassay detection of ferritin in whole blood

铁蛋白检测新型上转换纳米颗粒侧流免疫层析法灵敏度高范围宽

　　

作者：王志晨 | 周伟 | 崔月

单位：北京大学材料科学与工程学院，血管稳态与重塑国家重点实验室，北京 100871，中国

摘要

检测铁蛋白对于诊断诸如过量输血、营养不良、肝脏疾病、各种恶性肿瘤、缺铁性贫血、营养性贫血和失血等情况至关重要。然而，传统的检测方法存在一些挑战，包括耗时较长、程序复杂、设备笨重以及受到背景信号的干扰。在这项研究中，我们首次提出了一种基于强荧光NaLuF₄:Yb,Er,Mg上转换纳米颗粒（UCNPs）的侧向流动免疫测定（LFIA）平台用于铁蛋白的检测。掺镁的UCNPs具有更高的发光强度，分别比传统的NaLuF₄:Yb,Er和NaLuF₄:Yb,Er@NaLuF₄ UCNPs高出17倍和2倍。同时，这种单层结构使得LFIA探针的制备时间更短。利用夹心LFIA技术，NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs的荧光强度与铁蛋白浓度成正比，可以通过智能手机平台方便地读取检测结果。这种优化了UCNP探针的LFIA平台具有高灵敏度、宽检测范围和高稳定性的优点。在缓冲液中，铁蛋白的检测限低至0.050 ng/mL；在全血中的检测限为0.109 ng/mL，检测范围为0.1至200 ng/mL。本研究为铁蛋白的即时检测提供了一种有效的UCNP探针，并为高性能LFIA探针的设计提供了新的思路。

引言

铁蛋白是一种存在于体内所有细胞中的铁储存蛋白[1]。测量铁蛋白水平是评估机体铁储存状况的重要方法[2]。正常女性的铁蛋白参考范围为15至200 ng/mL，男性为30至300 ng/mL[3],[4],[5]。铁蛋白水平升高常见于接受过量输血、营养不良或患有肝脏疾病的患者中；相反，铁蛋白水平降低主要与缺铁性贫血、营养性贫血或失血有关[6],[7]。鉴于其重要的临床意义，铁蛋白检测在医院的多种医疗环境中以及临床实验室中都有应用。然而，传统的检测方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA）、电化学检测（ECD）、浊度免疫测定（TIA）和放射免疫测定（RIA）需要复杂的设备，操作人员需要具备专业技能，并且耗时且相对昂贵[8],[9],[10],[11]。侧向流动免疫测定（LFIA）技术作为一种有前景的即时检测方法受到了广泛关注[12],[13]以及现场检测[14],[15],[16]。尽管已有研究使用铑和金纳米颗粒进行铁蛋白的LFIA检测，但它们的性能（尤其是在灵敏度和稳定性方面）仍然有限[16],[17]。

UCNPs具有独特的优势，如几乎无背景干扰、低毒性、高稳定性和较长的发光寿命，这使得它们在生物检测中得到广泛应用[18],[19],[20],[21]。然而，UCNPs的低发光效率限制了它们高灵敏度检测微量分析物的能力，这仍然是其进一步发展的一个重要障碍[22],[23],[24]。人们已经探索了多种策略来构建具有增强发光特性的UCNPs。例如，核壳结构的设计可以有效减少表面淬灭，从而提高发光效率[25]。微球结构的形成使得UCNPs在微球内部显著聚集，增强了单个微球的发光强度[26]。表面等离子体激子纳米腔调制利用亚波长级的表面等离子体激子纳米腔来集中光线，从而增强了局部光场与量子发射体之间的相互作用，最终提高了稀土离子的发光强度和方向性[27]。尽管这些研究提高了UCNPs的发光强度，但也带来了一些挑战，因为它们通常需要较长的制备时间或复杂的程序。最近的研究表明，用金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ag⁺、Fe³⁺、Mn²⁺）掺杂UCNPs可以改变晶体场的对称性，从而显著提高UCNPs的发光强度并简化合成过程[28],[29],[30],[31],[32]。尽管金属离子掺杂的UCNPs具有潜力，但由于难以控制UCNPs的均匀性、形态和粒径，它们在LFIA中的应用尚未得到全面研究。例如，Li⁺或Mn²⁺的掺杂往往会引发晶格应变和缺陷，导致局部晶格常数的变化，打破生长各向同性，并形成纳米球、纳米棒和纳米棱柱等多种形态。此外，高浓度的Li⁺或Mn²⁺掺杂会使NaLuF₄从六方相转变为立方相，导致多相共存和形态多样性[33],[34]，这使得在LFIA中难以保证迁移速率、结合效率和信号输出的一致性。

在这项研究中，我们首次开发了一种基于NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs的LFIA方法，用于灵敏地检测铁蛋白。NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs通过一步热分解法制备，具有良好的均匀性、适中的尺寸和强的发光性能，非常适合用于LFIA。添加Mg²⁺提高了NaLuF₄:Yb³⁺,Er³⁺晶体的晶格结晶度，并降低了发光中心附近的晶体场对称性，从而显著提高了发光强度。当用作LFIA探针时，NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs与铁蛋白检测抗体结合，T线上的UCNP浓度与铁蛋白浓度成正比。在980 nm激光激发下，520 nm、544 nm和655 nm处的荧光发射分别对应于Er³⁺离子的²H_11/2→⁴I_{15/2、⁴S3/2→⁴I15/2和⁴F9/2→⁴I15/2能级跃迁[35]。T线发出的荧光信号可以通过智能手机捕获。此外，基于UCNPs的LFIA进行了优化，对其灵敏度、检测范围、特异性和稳定性进行了全面评估。最后，验证了直接从全血中检测铁蛋白的可行性，展示了该平台在即时检测方面的巨大潜力。}

材料

材料

六水合氯化镱（YbCl₃·6H₂O，99.99%）、六水合氯化铒（ErCl₃·6H₂O，99.99%）、六水合氯化镥（LuCl₃·6H₂O，99.99%）、氯化镁（MgCl₂，97%）、氢氧化钠（NaOH，97%）、四氟硼酸硝基鎓（NOBF₄，96%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国）。氟化铵（NH₄F，99.9%）和聚丙烯酸（PAA，分子量=5000）购自上海麦克莱恩生化科技有限公司（上海，中国）。

基于UCNPs探针的LFIA原理

作为LFIA探针，UCNPs具有多个优点，包括较大的抗斯托克斯位移、低背景干扰和高稳定性。然而，UCNPs的量子产率相对较低。为了提高UCNPs的荧光强度，从而提高LFIA平台的灵敏度和准确性，我们采用了镁掺杂策略。图1(a)展示了Mg²⁺掺杂UCNPs的合成过程及相应的生物偶联方法。

结论

在这项工作中，我们开发了一种基于NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs的LFIA方法用于铁蛋白的检测。由于UCNPs在980 nm激光激发下具有强发光性能，该LFIA方法实现了高灵敏度、高稳定性和宽检测范围。具体而言，NaLuF₄:Yb,Er,Mg UCNPs的发光强度比传统的NaLuF₄:Yb,Er和NaLuF₄:Yb,Er@NaLuF₄ UCNPs探针分别提高了17倍和2倍。

CRediT作者贡献声明

周伟：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。崔月：审稿与编辑、监督、方法学设计、资金申请、数据分析。王志晨：撰写初稿、数据可视化、验证、实验研究、数据分析、数据整理

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（编号：2022YFB3204400）、国家自然科学基金（编号：52572310）、北京市科技计划（编号：Z251100004625024）、北京大学血管稳态与重塑国家重点实验室以及中国博士后科学基金（编号：2024M750113）的支持。