半花青素二聚体和单体激发态的弛豫动力学

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Relaxation dynamics of the excited states of Hemicyanine dimer and monomer

血色氰染料在低极性溶剂中形成二聚体，通过时间分辨荧光光谱和DFT计算证实其反平行π-π堆积结构，抑制单体中圆锥相交和内旋转的非辐射过程，显著提高荧光量子产率和寿命。

　　

杨向和|陈良轩|沈俊轩|Barbara Zenabu Anibea|刘青萍|刘伟民|陈一佳

国立清华大学化学系，新竹市，台湾300044，中华人民共和国

摘要

半花青素目前被广泛用作许多生物应用中的光敏剂。了解它们的激发态动力学对于提高其性能至关重要。本文使用时间分辨荧光技术研究了三种半花青素——二苯氨基苯乙烯吡啶inium（DPPy）、二苯胺苯乙烯吡啶inium（DAPy）和咔唑基氨基苯乙烯吡啶inium（CBPy）的光物理性质，包括单体和聚集体形式。研究发现，在极性较低的溶剂中会发生聚集现象，并且聚集体具有更高的荧光产率。这些聚集体的荧光强度衰减表现出一个时间组分τ_R,A，范围为30–300 ps，这被归因于非辐射过程——解离。通过荧光各向异性衰减可以确定聚集体的组成：扩散旋转松弛的时间常数与旋转物种的体积成正比。因此，聚集体的主要组成是二聚体。根据密度泛函理论计算，二聚体的结构被认为是头对尾的反平行π–π堆叠构型。单体S₁态的时间分辨荧光显示出一个第三时间组分τ_R1,m，范围为3到10 ps。这种快速衰减组分被暂时归因于圆锥交叉效应。第四个时间组分τ_R2,m（数十ps）被归因于由内部旋转引起的过程。这两种快速途径在单体中导致极低的发射产率，而在二聚体中则受到阻碍，从而产生较高的荧光量子产率和更长的寿命。

引言

花青素染料因其优异的生物相容性、低毒性和可调的吸收和发射范围而在生物技术中被广泛使用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。花青素染料通常由两个含氮杂环通过共轭碳链连接而成。通过调整链中碳原子的数量（单甲基、三甲基、五甲基和七甲基花青素），可以修改花青素染料的光物理性质[1]。与花青素不同，半花青素的一个含氮杂环被一个含氮的线性结构取代，如图1所示。目前，半花青素常被用作光动力疗法（PDT）中的光敏剂[11]、[12]。当被激发到激发态时，光敏剂会发生系间窜越（ISC）到三重态，然后进行I型电子转移或II型能量转移，产生活性氧物种（ROS），从而引起细胞毒性[13]。此外，由于近红外（NIR）光具有出色的皮肤穿透性能，通过将重原子引入结构并延长π-共轭链的长度来红移发射带，从而改进了半花青素染料的分子设计；这些染料进一步推动了PDT技术的发展，使其应用范围更广[14]、[15]。

Fromherz和Heilemann研究了氨基苯基吡啶inium（半花青素）染料中的扭曲电荷转移[16]，发现具有受限单键的结构比自由旋转单键结构的量子产率更高。他们得出结论，快速的非辐射松弛过程与可旋转单键的存在有关。Cao等人研究了反-4-[4-(二甲氨基)-苯乙烯]-1-甲基吡啶碘化物（4-DASPI，结构见图1）中的四个潜在可旋转键，并认为围绕苯胺-乙烯键（?₂）的旋转最有可能实现扭曲的分子内电荷转移（TICT）状态，这导致快速的非辐射衰减过程，并导致非常低的量子产率[17]。类似地，也提出了1-乙基-2-(4-p-二甲氨基苯基)-1,3-丁二烯基)吡啶inium高氯酸盐（LDS-698）半花青素染料中的非辐射衰减也涉及TICT[18]。

Yu等人研究了三种半花青素染料的ROS生成途径：二苯氨基苯乙烯吡啶inium（DPPy）、二苯胺苯乙烯吡啶inium（DAPy）和氨基苯乙烯吡啶inium（CBPy），它们的 counter ion 都是I^?（结构见图1）[19]。他们发现，这些染料的ROS生成途径取决于电子供体：在DAPy中引入电子供体基团会使分子更倾向于进行I型电子转移以产生O₂^-。相反，像CBPy那样改变供体结构以降低电子转移效率，会使分子倾向于进行II型能量转移以生成¹O₂。因此，这三种半花青素染剂优先生成不同的ROS。

在本研究中，我们研究了DPPy、DAPy和CBPy的激发态松弛动力学。在这些分子中，苯胺作为电子供体，吡啶作为电子受体。这些化合物表现出非常低的发射量子产率，由于缺乏重原子，ISC的效率也预期较低。Huang等人表明，半花青素染料4-DASPI在约470 nm处显示出强烈的吸收带，并将其归因于来自发色团苯胺到吡啶的电荷转移ππ*跃迁[20]。然而，他们发现当4-DASPI溶解在四氢呋喃（THF）或乙酸乙酯（EA）中时，其吸收光谱与在质子溶剂中的不同，在370 nm处显示出明显的吸收带。这些半花青素是带大偶极子的阳离子染料，导致在THF和EA等低极性溶剂中的溶解度较差。这种低溶解度使它们容易聚集。因此，370 nm处的吸光增强带被归因于H型聚集体的存在。

与花青素类似，许多关于半花青素聚集的研究表明其发射得到增强[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。这些聚集体可能表现出与单体不同的光物理性质。此外，一些问题仍未解决，例如它们的分子结构中缺乏重原子，导致自旋-轨道耦合（SOC）较低。因此，到三重态的ISC不太有利。在这种情况下，ROS生成机制仍然是一个值得进一步研究的课题。因此，激发态松弛机制需要进一步研究。

在这项工作中，我们利用时间分辨荧光光谱——时间相关单光子计数（TCSPC）和荧光光门控（FOG，一种上转换方法）来获取时间信息，以解析激发态的松弛过程。在极性较低的溶剂中形成的半花青素聚集结构尚未得到充分研究。因此，采用了密度泛函理论（DFT）来解析可能的二聚体结构及其电子性质。

部分摘录

化学品

DPPy（C₂₆H₂₃N₂I）、DAPy（C₂₈H₂₇N₂O₂I）和CBPy（C₂₆H₂₁N₂I）的合成方法与之前描述的相同[19]。使用的溶剂包括乙腈（ACN，Riedel-de Ha?n，99%）、四氢呋喃（THF，TEDIA，99.8%）、1,4-二氧环己烷（p-DOX，J. T. Baker，99.0%）和甲苯（Mallinckrodt，99.7%）。水中的Stilbene 3（Exciton）被用作343 nm激发下的荧光量子产率测量标准，而乙醇中的罗丹明101（Sigma-Aldrich）被用作另一个标准

3.1. 稳态光谱

图2显示了DPPy、DAPy和CBPy在343 nm激发波长（λ_ex）下的吸收和发射光谱，以及DPPy和DAPy在ACN、THF和p-DOX中的532 nm激发波长下的光谱。DPPy和DAPy在甲苯中的光谱也记录在同一图中。三种半花青素显示出相似的光谱特征。CBPy显示出最蓝移的带，因为它的电荷转移能力最低；因此，CBPy的最低能量电子带无法被访问

单体

从时间分辨数据中，我们在单体S₁态中识别出两个非辐射途径，这解释了低量子产率的原因。关于快速的τ_R1,m过程，S₁是一个从苯胺到吡啶部分的ππ*电荷转移态，其中电子密度主要转移到吡啶部分。许多研究[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]表明吡啶的激发态ππ*存在圆锥交叉效应，其时间常数与τ_R1,m相似

结论

实验数据显示，即使在p-DOX中，单体的S₁态的量子产率也非常低，这与两个非辐射松弛过程有关。我们认为这些过程可能是通过吡啶部分上的圆锥交叉效应和沿?₂的快速内部旋转来将电子能量松弛回基态表面。

从荧光各向异性衰减和理论计算来看，我们提出DPPy、DAPy和CBPy表现出

CRediT作者贡献声明

杨向和：撰写——原始草稿，研究，正式分析，数据管理。陈良轩：撰写——原始草稿，研究，正式分析，数据管理。沈俊轩：撰写——原始草稿，研究，正式分析，数据管理。Barbara Zenabu Anibea：方法学，研究，正式分析。刘青萍：监督，资源，方法学，概念化。刘伟民：监督，资源，方法学，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢中华人民共和国国家科学技术委员会（NSTC 112-2113-M-007-028; 113-2113-M-007-009; 114-2116-M-007-004）对这项研究的财务支持，以及国家高性能计算中心提供的计算资源和设施。