《Protein Science》：From transporter to motor: Evolutionary and structural insights into the emergence of prestin's area-motor activity in mammals
编辑推荐：
本研究聚焦于听觉神经科学的关键蛋白prestin（SLC26A5），其从祖先阴离子转运体演化为哺乳动物外毛细胞中驱动电致运动（electromotility, EM）的电压敏感面积马达。研究人员通过祖先序列重建（ASR）、AlphaFold2-multimer结构建模与分子动力学模拟，揭示了200多个氨基酸替换沿哺乳动物谱系的分布规律，发现早期替换集中于跨膜结构域（TMD）以调节蛋白-脂质相互作用，晚期替换则聚集在STAS结构域的插入序列（IVS）中，促使IVS环形成带负电斑块（negative patch, NP），可能影响氯离子动态与电压响应。该工作为理解复杂生物物理性状的分子进化提供了框架，阐明了prestin如何通过保守支架内的分布式替换实现功能创新。
在哺乳动物的听觉系统中，耳蜗放大器对声音的敏感度和频率分辨起着至关重要的作用。这一放大过程的核心是外毛细胞（outer hair cells, OHCs）表现出的电致运动（electromotility, EM），即细胞能够响应电刺激快速改变体长。驱动这种高速机械运动的关键蛋白是prestin，它是SLC26A家族的一员，密集分布于OHCs的侧膜中。有趣的是，prestin在哺乳动物中扮演着电压敏感面积马达的角色，能将电压变化转化为机械功；然而，在非哺乳动物中，其同源物却主要发挥阴离子转运功能。这种从离子转运体到高速马达的功能转变是如何在进化中发生的？其背后的分子与结构基础是什么？尽管已知哺乳动物prestin几乎丧失了转运能力，并表现出显著的非线性电容（nonlinear capacitance, NLC）——电压敏感性的标志，但其功能转换的具体机制，尤其是关键氨基酸替换如何微调这一机制，仍不完全清楚。为此，研究团队在《Protein Science》上发表了最新成果，通过整合进化分析与计算结构生物学方法，揭示了prestin功能演化的详细图景。
本研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先，研究人员对脊椎动物prestin进行了祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction, ASR），推断出12个高置信度的祖先序列；其次，利用AlphaFold2-multimer对包括人类prestin（HsPres）在内的祖先及现存代表进行了全长的结构建模；接着，通过基于1的构象采样（包括随机种子和dropout选项、以及多序列比对深度调整）探索了柔性区域（如EC-loop和IVS-loop）的构象多样性；最后，对选定的祖先模型进行了原子水平的分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，以评估替换的结构效应并分析氯离子结合位点的动力学。所用序列来源于公共数据库，并经过严格过滤和比对。
研究结果
2.1 ASR鉴定了prestin结构域中关键的进化替换
通过构建脊索动物SLC26A5亚族的系统发育树并利用ASR，研究团队推断出12个高置信度祖先序列。分析从鱼类到胎盘哺乳动物的进化路径（ancPis → ancRhi → ancTre → ancAmn → ancMam → ancThe → ancPla），共识别出206个氨基酸替换。其中早期替换（ancAmn → ancMam）有107个，中期（ancMam → ancThe）19个，晚期（ancThe → ancPla）21个，还有38个两步替换和17个三步替换。这些替换在N端结构域、跨膜结构域（TMD）和STAS结构域的分布比例不同，且72%为非保守替换，即改变了残基的物理化学性质。结果表明，prestin的进化涉及大量氨基酸替换，且在STAS结构域晚期、非保守替换偏多。
2.2 构象采样揭示STAS结构域的IVS-loop区分了哺乳动物prestin
利用AlphaFold2-multimer对包括人类prestin（HsPres）在内的祖先及现存序列进行结构预测和构象采样。结果显示，所有模型的TMD和STAS结构域折叠部分结构高度相似，但细胞外环（EC-loop）和插入序列环（IVS-loop）等柔性区域存在构象差异。最为显著的结构分歧出现在IVS-loop：在非哺乳动物祖先和现存代表中，IVS形成一个延长的Cα2螺旋和一个长的无序环；而在哺乳动物祖先中，特别是胎盘哺乳动物（如ancPla、人类、沙鼠、海豚和蝙蝠），Cα2螺旋发生断裂（Cα2 + Cα2′），导致IVS-loop重新定位于相邻单体的胞内入口附近。这种构象差异与序列差异相关，提示IVS-loop是区分哺乳动物prestin与其祖先及非哺乳动物同源物的最突出结构特征。
2.3 将替换映射到HsPres和重建祖先的结构模型中
将替换映射到HsPres模型上，发现早期替换遍布TMD和STAS结构域，其中非保守早期替换聚集在TM5b、TM6、EC-loop和STAS结构域。中期替换主要位于TM5b、TM6和STAS结构域。晚期替换则见于EC-loop、TM5b-TM6环以及STAS结构域。两步和三步替换出现在EC-loop和STAS结构域，表明这些位置的替换限制较少。
2.4 TMD中的替换显示在门控结构域聚集
TMD中近20%的残基发生了替换，其中55个为非保守替换。早期和中期替换靠近或远离氯离子结合位点，而晚期替换则距离较远。替换并非均匀分布，门控结构域（支架）的替换多于核心结构域（转运），其中TM5b、TM6和TM12的替换数量最多。值得注意的是，尽管prestin功能涉及核心与门控结构域之间的相对取向变化，但核心-门控界面上的替换很少。然而，在连接TM7-TM8和TM11-TM12的结构域间连接子附近发现了一个替换网络，这可能改变了结构域间的偶联及功能构象变化。
2.5 TMD中的多个替换影响蛋白-脂质界面
许多替换位于螺旋的脂质面，尤其是在门控结构域，这表明从转运体到面积马达的进化转变可能涉及prestin与膜相互作用方式的显著改变。研究识别出两组可能最相关的非保守替换：第一组是七个由非极性残基替换为苯丙氨酸的替换，主要位于螺旋的胞外或胞内末端附近，并集中在门控结构域；第二组是TM13中的四个早期非保守替换，导致仅在哺乳动物prestin中出现的独特模式。MD模拟显示，哺乳动物prestin的TM13和TM14螺旋间的距离更近，单体的空间减小，这可能影响了脂质占据。这些替换可能改变了蛋白-脂质相互作用，与已知的哺乳动物prestin对膜厚度、张力等变化的敏感性差异相关。
2.6 EC-loop构型与非哺乳动物和哺乳动物prestin的功能差异相关
EC-loop是连接TM3和TM4的胞外环，已知对NLC/EM至关重要。研究发现该区域积累了五个早期、三个晚期和一个三步替换。在非哺乳动物祖先中，该环朝向其单体的胞外面，易于与TM4、TM5-TM5b环和TM5b的残基形成相互作用；而在哺乳动物祖先中，该环向外指向，使TM3和环与其他区域解偶联，在胎盘祖先ancPla和HsPres中更为明显。构象采样和MD模拟表明，哺乳动物EC-loop的构象灵活性增加，与邻近区域（特别是TM5b）的相互作用减少。这些变化可能影响了其与TMD的偶联。
2.7 胎盘哺乳动物prestin中独特的IVS-loop源于替换的积累
STAS结构域的插入序列是SLC26A家族中长度和氨基酸组成变异很大的区域。研究发现该区域积累了30个替换，导致非哺乳动物、早期哺乳动物和胎盘动物祖先间存在明显的序列差异，包括一个带正电斑块的消除和一个带负电斑块在胎盘哺乳动物中的出现。结构上，哺乳动物祖先（自ancThe起）出现了非保守的中期替换K583G*，导致Cα2螺旋断裂为Cα2和Cα2′两段，并形成一个由E609、E610和D611组成的带负电斑块。构象采样显示，胎盘哺乳动物的IVS-loop存在“近”和“远”两种构象状态，而非哺乳动物祖先主要维持单一的“远”状态。MD模拟进一步证实，在人类prestin和ancMam中，IVS-loop更靠近相邻单体的氯离子结合位点，并能与TMD中的多个保守带正电残基形成瞬态盐桥。氯离子占据分析表明，哺乳动物系统中氯离子在结合位点的停留时间更长。这些变化提示，胎盘动物独特的IVS-loop构象可能通过调节氯离子动态或电压敏感性，在prestin的机电行为中发挥潜在调控作用。
2.8 面积马达功能出现的结构和进化模型
研究结果概括了prestin功能从非哺乳动物的离子转运，经单孔类动物的中间面积马达适应，到有胎盘哺乳动物强大、精细调节的电致运动和相应频率选择性的演进过程。这一转变是通过其结构框架内的分布式重塑实现的。TMD中的替换改变了膜界面和螺旋间接触，芳香族和极性残基在蛋白-脂质界面更为普遍，可能增强了膜锚定和变形。IVS-loop经历了最显著的创新，在胎盘哺乳动物中采用了一种将带负电斑块置于离子通道入口附近的新构象。总之，面积马达功能是通过在保守支架内对现有元件进行微调而出现的。
结论与讨论
本研究结合进化建模和原子模拟，将祖先序列变化与新兴的结构和动力学特性联系起来。通过整合ASR、结构建模、模拟和比较分析，揭示了prestin在哺乳动物中获得其独特面积马达功能的结构和进化框架。prestin从典型阴离子转运体向电压敏感马达蛋白的转变涉及一系列分布式的分子创新，而非单一决定性的突变或结构域获得。这些变化包括跨膜区脂质面残基的改变以及柔性环段的重排，它们共同调节膜嵌入、螺旋堆积和结构域间耦合。研究强调，prestin的功能创新是通过在保守结构框架内对现有元件进行渐进式优化而实现的，这为理解膜蛋白在分子水平上的功能创新提供了范例。
