卵黄囊及脐动脉生血内皮起源的胎儿限制性造血祖细胞的发现及其在胚胎淋巴髓系造血中的关键作用

《Nature Cardiovascular Research》：Fetal-restricted hematopoietic progenitors arise from hemogenic endothelium in vitelline and umbilical arteries

编辑荐语：针对胚胎造血“分层发生”过程中早期造血干祖细胞起源与贡献不清的问题，本研究利用小鼠遗传谱系示踪、单细胞转录组等技术，首次发现并证实E8.5-E9.5期间源自卵黄囊及脐动脉生血内皮的胎儿限制性造血干祖细胞（HSPCs）波，该群体是胎儿淋巴髓系造血的主要贡献者，出生后迅速衰减，重塑了对发育性造血时空层级的理解。

　　

在哺乳动物胚胎发育的奇妙旅程中，血液系统的构建堪称一场精密绝伦的“分层施工”。长期以来，科学家们知道造血并非一蹴而就，而是像叠罗汉一样，由不同来源、不同潜能的祖细胞一波接一波地涌现。这个被称为“分层造血”（layered hematopoiesis）的过程高度保守，但其具体细节却如同雾里看花。特别是，在具有长期自我更新能力的成体型造血干细胞（HSCs）登场之前，那些短暂存在的早期造血祖细胞究竟从何而来？它们如何塑造了胎儿的血液系统？这些问题的答案一直扑朔迷离。

过去的研究主要关注主动脉-性腺-中肾（AGM）区作为成体HSCs的发源地，以及卵黄囊（YS）作为红系髓系祖细胞（EMPs）和淋巴髓系祖细胞（LMPs）的摇篮。然而，现有的模型难以解释为何在HSCs成熟之前，胎儿已经拥有了复杂的淋巴髓系细胞组成。是否存在一个被忽视的早期造血波次？它是否隐藏在那些看似不起眼的血管角落里？带着这些疑问，由Barone等人领衔的研究团队在《Nature Cardiovascular Research》发表了一项突破性成果，揭开了这一谜团。他们利用高精度的遗传谱系示踪技术，锁定了卵黄囊连接处及脐带血管中的一个全新造血前体细胞库。

为了精准捕捉这群 elusive 的细胞，研究人员设计了一套精妙的“脉冲追踪”策略。他们采用了他莫昔芬（4-OHT）诱导的Cdh5-CreER^T2小鼠模型，这就像给细胞打上了一个时间敏感的“条形码”。通过在胚胎发育的第7.5天（E7.5）、E8.5和E10.5这三个关键时间窗口精确给药，他们能够分别标记不同批次的生血内皮（HE）。结合R26^tdTomato、R26^zsGreen等报告基因，研究人员实现了对连续造血波的差异化标记。此外，他们还运用了Csf1r-iCre和Csf1r^MerCreMer模型来特异性追踪EMPs及其后代的命运。为了全景式解析细胞命运，研究团队采用了整体免疫荧光成像（WM-IF）技术，配合共聚焦显微镜，直接在三维层面观察血管壁上Kit⁺造血簇的分布与标记情况。在分子层面，他们利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）深入剖析了E10.5时期AGM区和YS+VU（卵黄囊+脐血管）中造血祖细胞的转录组异质性。最后，通过竞争性移植实验，验证了不同时间点标记的细胞在受致死剂量辐照的受体小鼠体内的长期重建能力和分化潜能。所有实验均基于严格的时间点采样，涵盖了从E9.5到成年期的多个阶段。

HE lineage tracing identifies a population of fetal-restricted hematopoietic progenitors

通过对不同时间点激活的Cdh5-CreER^T2模型进行分析，研究发现E7.5给药主要标记了卵黄囊的EMPs，而E10.5给药则高效标记了成体型的HSCs。令人惊讶的是，E8.5给药虽然未能有效标记EMPs或成体型HSCs，却在E11.5的AGM区和YS+VU区域标记了大量表型造血祖细胞（非pre-HSCs）以及II型pre-HSCs（CD31⁺Kit⁺CD41^lowCD45⁺CD43⁺CD201⁺）。更重要的是，这些被E8.5标记的细胞在E14.5胎肝（FL）HSCs中占有一定比例（平均58%），但在E16.5降至25%，在成年骨髓（BM）中仅剩10%。这表明E8.5标记的HE产生了一群在胎儿期活跃、出生后迅速衰减的“胎儿限制性HSPCs”。

Fetal lympho-myelopoiesis is largely contributed from hematopoietic progenitors originating from E8.5–E9.5 HE

为了评估这群细胞的生理功能，研究人员分析了E16.5胎儿的组织。结果显示，E8.5激活的Cdh5-CreER^T2模型导致了胎肝中约70%的B细胞和髓系细胞、胸腺中50-60%的胸腺细胞被标记，其中双阳性（CD4⁺CD8⁺）T细胞和γδ T细胞的标记效率最高。相比之下，E7.5激活（标记EMPs）的贡献微乎其微，而E10.5激活（标记成体型HSCs）的贡献主要在出生后显现。纵向追踪显示，E8.5来源的标记细胞在出生后迅速下降，而E10.5来源的细胞则逐渐增加，揭示了从胎儿造血程序向成体造血程序的“接力棒交接”。

Fetal-restricted HSPCs first emerge from HE of the vitelline and umbilical arteries

这群关键的祖细胞最初在哪里诞生？整体成像给出了直观的答案。在E9.5的胚胎中，位于卵黄动脉（VA）靠近背主动脉（DA）部分的Kit⁺造血簇，几乎完全由E8.5激活的HE产生，而E7.5激活则几乎没有标记。到了E10.5，VA和脐动脉（UA）中的造血簇被E8.5激活强烈标记，而DA中的簇则标记较弱。值得注意的是，此时DA腹侧的血管内皮并未被标记，这与成年骨髓HSCs未被标记的结果一致。这些数据明确将胎儿限制性HSPCs的起源定位于VA和UA的HE。

EMPs do not significantly contribute to hematopoietic clusters in intra- and extra-embryonic arteries

为了排除EMPs的干扰，研究人员使用了Csf1r-iCre模型。结果显示，E9.5 VA中的Kit⁺簇几乎不表达tdTomato，尽管此时的EMPs已被高效标记。同样，E10.5 DA、VA和UA中的造血簇也极少被标记，证实了这些动脉簇并非源自EMPs，而是代表了一个独立的造血波次。

A late wave of Csf1r⁺progenitors exerts a limited contribution to fetal lympho-myelopoiesis

进一步利用Csf1r^MerCreMer模型，研究发现E9.5激活仅标记了少量胎肝巨噬细胞，而E9.5激活则能标记一部分B细胞和胸腺细胞，且在胸腺中的贡献高于胎肝。这表明Csf1r⁺祖细胞存在两个波次：早期的EMP波（E8.5激活）主要负责红髓系生成，晚期的波次（E9.5激活）才获得有限的淋巴潜能。

B and T lymphoid potential appears in intra- and extra-embryonic HE between E8.5 and E9.5

功能实验证实了转录组的结果。集落形成单位（CFU-C）实验显示E8.5和E7.5标记的细胞在红髓系潜能上没有显著差异。然而，在OP9和OP9-DL1共培养体系中，只有E8.5标记的AGM和YS+VU细胞才能高效地分化为B细胞和T细胞。极限稀释分析（LDA）更是量化了这一差异：在AGM区，T细胞祖细胞的频率为1:81，而B细胞祖细胞为1:204；在YS+VU区域，频率分别为1:123和1:314。这证明淋巴潜能是在E8.5-E9.5期间才出现在HE中的。

Single-cell transcriptomics coupled with HE lineage tracing identify distinct subsets of pre-HSPCs in AGM and YS?+?VU

单细胞测序揭示了更深层的异质性。在E10.5的AGM和YS+VU中，研究人员鉴定出两个主要的pre-HSPC亚群。Pre-HSPC 1主要由AGM的tdT^?细胞和YS+VU的tdT^?细胞组成，高表达Hlf、Mecom、Hoxa7/9等干细胞基因，代谢特征偏向糖酵解，表现出未分化的状态。Pre-HSPC 2则主要由YS+VU的tdT⁺细胞构成（>75%），高表达分化相关基因和氧化磷酸化（OXPHOS）相关基因，核糖体基因活跃，显示出准备分化的特征。这种转录组的差异印证了空间位置的分工：AGM内的细胞偏向维持干细胞特性，而YS+VU内的细胞则倾向于快速分化。

Differentially labeled CD27⁺Kit⁺hematopoietic clusters selectively localize to vitelline and umbilical arteries

为了在体内验证这一发现，研究人员利用了CD27这一标志物。他们发现，在E10.5，VU中的Kit⁺簇比DA或YS动脉表达更高水平的CD27。更重要的是，这些CD27⁺的簇主要被E8.5激活标记，并且特异性地定位于VU区域，而在DA中几乎检测不到。这从蛋白水平证实了胎儿限制性pre-HSPCs的解剖学定位。

Fetal-restricted HSPCs and adult-type HSCs show distinct dynamics of engraftment

最终的移植实验揭示了功能本质。将E11.5 AGM细胞移植入致死剂量辐照的受体后，只有E8.5激活来源的细胞能够在受体外周血（PB）中长期重建髓系和淋巴系细胞，但这些受体骨髓中检测不到表型HSCs。相反，E10.5激活来源的细胞虽然在PB中无重建能力，但在体外移植实验中显示出更强的长期重建潜力。进一步的竞争移植显示，E14.5胎肝中E8.5标记的细胞可以在初次移植中重建多系造血，但在二次移植中迅速衰竭；而E10.5标记的细胞则在二次移植中持续存在。这表明胎儿限制性HSPCs具有多系分化能力但缺乏长期自我更新能力，而成体型HSCs则需要胎肝微环境的进一步成熟才能获得完全的重建功能。

综上所述，这项研究填补了胚胎造血领域的一个关键空白。它确立了卵黄动脉和脐动脉的生血内皮作为一个全新的、此前未被识别的造血前体细胞来源，这些细胞在E8.5-E9.5期间产生，构成了胎儿淋巴髓系造血的主力军。研究通过精细的谱系追踪和时空定位，绘制了一张更为完整的“造血地图”，明确了胎儿限制性HSPCs与成体型HSCs在空间起源、转录特征和功能命运上的根本区别。这不仅刷新了我们对“分层造血”理论的认知，强调了代谢和炎症信号在造血命运决定中的作用，也为理解儿童期起源于胚胎发育阶段的血液系统疾病（如白血病）提供了全新的视角——或许某些疾病的种子就埋藏在这些短暂的胎儿限制性祖细胞之中。