通过硫化氢介导的抗氧化和抗炎途径，实现远端缺血预处理对肾脏的时效性保护

《Tissue and Cell》：Time-Dependent Renal Protection by Remote Ischemic Preconditioning through a Hydrogen Sulfide–Mediated Antioxidative and Anti-Inflammatory Pathway

远程缺血预适应对肾缺血再灌注损伤的保护作用及硫化氢信号通路机制研究。通过比较早期（<1小时）和晚期（>24小时）RIPreC对肾损伤的影响，发现晚期预处理效果更显著，其机制与H2S信号通路激活相关，通过上调CBS和CSE表达减轻氧化应激和炎症反应。NaHS增强保护作用而PAG抑制。

　　

Khojasteh Malekmohammad、Firouzeh Gholampour、Zeinab Karimi、Gholamreza Daryabor

伊朗设拉子大学理学院生物系

摘要

本研究比较了早期（<1小时）和晚期（>24小时）远端缺血预处理（RIPreC）对肾缺血/再灌注（I/R）损伤的保护作用，并阐明了H?S信号通路在介导RIPreC诱导的肾保护中的作用。将56只雄性大鼠随机分为8组：对照组、I/R组、早期RIPreC+I/R组、晚期RIPreC+I/R组、NaHS+早期RIPreC+I/R组、NaHS+晚期RIPreC+I/R组、PAG+早期RIPreC+I/R组和PAG+晚期RIPreC+I/R组。通过阻断肾动脉60分钟来诱导肾I/R，随后进行24小时的再灌注。RIPreC通过三次股动脉阻断和再灌注循环来实现，每次循环持续5分钟。再灌注后收集血液、尿液和肾脏组织样本。肾I/R导致严重的肾功能障碍、FE_Na升高、C_Cr降低、尿液渗透压升高以及氧化应激增加和组织损伤。这些变化伴随着CBS和CSE的下调以及NF-κB和TNF-α的上调。早期和晚期RIPreC均能保护肾功能，降低总氧化状态，增强总抗氧化能力，减轻炎症，并改善组织损伤。值得注意的是，晚期RIPreC的保护作用优于早期RIPreC。NaHS的给药增强了RIPreC的效果，而PAG则抵消了这些效果。RIPreC通过上调CBS和CSE来激活氢硫化物（H?S）信号通路，从而发挥显著的肾保护作用。

引言

急性肾损伤（AKI）的特征是在数小时内肾小球滤过率（GFR）迅速显著下降，导致血清中氮代谢产物（如血尿素氮（BUN）和肌酐）浓度升高，同时尿量减少（Han和Lee，2019；Tomsa等，2019）。缺血-再灌注（I/R）是AKI和肾组织损伤的常见原因。肾I/R会触发一系列信号级联反应，引发对缺血和血流恢复的炎症和氧化应激反应，最终导致AKI（Malek和Nematbakhsh，2015）。I/R损伤涉及过量的活性氧（ROS）生成以及内源性抗氧化酶的减少（Gyurászová等，2020）。此外，这一现象与强烈的炎症反应密切相关，表现为缺血肾组织中炎症细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放增加（Sharfuddin等，2011；Takada等，1997）。因此，氧化应激和促炎因子都会导致缺血后肾损伤（Sedaghat等，2016）。

气体递质作为一种创新的治疗手段，已被证明可以减少I/R引起的肾损伤（Choi等，2018；Moody和Calvert，2011）。氢硫化物（H₂S）是气体递质类中最重要的成分之一，仅次于一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）（Du等，2019；Lobb等，2014）。在体内，H₂S由L-半胱氨酸（L-Cys）通过三种主要酶生成：3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）、半胱硫氨酸β-合成酶（CBS）和半胱硫氨酸γ-裂解酶（CSE）（Kimura，2011）。CBS和CSE在肾脏中含量丰富（Han等，2015）。H₂S参与多种生理过程，包括血管生成、血管舒张、葡萄糖稳态和神经调节（Du等，2019；Tan等，2015；Wu等，2015）。多项研究表明，H₂S在AKI后恢复肾功能方面具有重要作用，因其具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用（Azizi等，2016；Hashmi等，2021；Tan等，2015）。然而，有证据表明，使用D,L-丙炔基甘氨酸（PAG）和氨基氧乙酸（AOAA）抑制CBS和CSE会增加肾脏对I/R损伤的敏感性（Choi等，2018；Han等，2015）。

此外，人们越来越关注一种称为缺血预处理（IC）的新治疗方法，特别是远端缺血预处理（RIC）。远端缺血预处理（RIPreC）作为一种安全、无成本且临床可行的方法，可以通过提高肾脏组织对后续缺血损伤的耐受性来降低AKI的发生率（Jung等，2019；Zhou等，2018）。该方法提供两个不同的器官保护时间窗口：急性/早期阶段（RIPreC后4小时内）和延迟/晚期阶段（RIPreC后24-72小时）（Cho等，2017；Varga等，2020；Yoon等，2015a；Yoon等，2015b）。

一些有限的动物研究通过测量肾损伤生物标志物（Yoon等，2015a）、血液学和组织学评估（Varga等，2020）、微阵列分析（Yoon等，2015b）以及多组学方法（Cho等，2017）比较了早期和晚期RIPreC的效果。然而，目前尚无明确的时间窗口或经过验证的方案来优化RIPreC的肾保护效果。

此外，先前的临床试验已经证实了延迟RIPreC在心脏手术患者中的肾保护作用（Jia等，2024；Kim等，2017）。研究结果表明，它能够降低AKI及其相关并发症的发生率（Jia等，2024；Kim等，2017）。根据文献，早期RIPreC可以改善活体供体肾移植后的肾功能（Bang等，2019；Veighey等，2019）。然而，目前尚无标准化的操作方案。

RIPreC的肾保护机制包括体液、细胞和神经因素（Yoon等，2015b），以及其他重要因素，如一氧化氮（Jung等，2019）、microRNAs（Pan等，2019）以及抗氧化和抗炎分子（Hussein等，2016）。所有这些因素都参与了肾脏对I/R损伤的抵抗。目前只有少数研究探讨了H₂S在RIPreC保护机制中的作用；迄今为止，仅研究了其心脏保护（Wang等，2021）和神经保护（He等，2019）效果。关于H₂S在RIPreC引起的肾保护中的信号通路作用尚未有报道。

因此，我们假设RIPreC通过CSE/CBS介导的H₂S生成信号通路来保护肾脏免受IRI的影响。这一机制显著减少了缺血肾组织中的氧化应激和炎症反应。因此，本研究旨在A）确定最有效的RIPreC方案并阐明其确切的作用机制，以及B）探讨H₂S在RIPreC对抗I/R诱导的AKI的肾保护中的作用。

动物实验

实验动物为成年雄性Sprague–Dawley大鼠，体重在230–250克之间（8-10周龄），来自伊朗设拉子医科大学（SUMS）的动物中心。大鼠在受控的环境条件下饲养，光照/黑暗周期为12小时/12小时，温度为22-25°C，湿度为50±10%，实验开始前可自由进食和饮水。动物护理遵循相关规范。

早期和晚期RIPreC改善了I/R引起的肾功能变化

如图2所示，与对照组相比，肾I/R显著增加了血浆肌酐（[Cr]_P）和尿素氮（[UN]_P水平（图2A–B），降低了肌酐清除率（C_Cr）（图2C），并提高了FE_Na（图2D）（所有P < 0.001）。早期和晚期RIPreC均减轻了这些变化，其中晚期RIPreC的保护作用更强（尤其是C_Cr升高更明显，[Cr]_P、[UN]_P和FE_Na的降低幅度更大；P < 0.001）。NaHS联合治疗进一步改善了肾功能。

讨论

本研究首次证明了氢硫化物（H?S）在介导远端缺血预处理（RIPreC）对肾缺血/再灌注（IRI）损伤的保护作用和/或潜在机制中的关键作用。利用双侧肾缺血的大鼠模型，我们比较了早期（<1小时）和晚期（>24小时）RIPreC对肾功能、氧化应激、炎症和组织病理的影响。结果显示，肾I/R导致了显著的功能障碍

结论

总之，本研究表明，早期和晚期RIPreC均能通过改善肾功能、减少氧化应激和炎症、保护H?S生物合成酶（CBS和CSE）以及最小化组织损伤来有效预防肾I/R损伤。晚期RIPreC方案比早期方案更有效，表明延迟阶段提供了最佳的治疗窗口。重要的是，药理学实验证实H?S信号通路在保护过程中起着关键作用。

伦理批准

本研究方案获得了设拉子大学动物伦理委员会的批准（伦理代码：IR.US.PSYEDU.REC.1403.096）。所有程序均符合规定的方案和法规。此外，本研究符合ARRIVE指南的要求。

资助

设拉子大学研究委员会提供了财务和技术支持，资助编号为88-GR-SCST-117。

作者声明

我们声明本手稿是原创的，此前未发表过，也没有其他地方正在考虑发表。我们确认所有署名作者均已阅读并批准了该手稿，且没有其他符合作者资格但未列出的人员。我们进一步确认手稿中作者的排序得到了所有人的同意。我们理解通讯作者是唯一的联系人。

作者贡献声明

Khojasteh Malekmohammad：撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析。Firouzeh Gholampour：审稿与编辑、数据可视化、项目监督、资金筹集、概念构思。Zeinab Karimi：数据验证、方法设计、数据分析。Gholamreza Daryabor：数据可视化、结果验证。

利益冲突声明

作者声明没有财务或其他利益冲突。

致谢

作者衷心感谢设拉子大学研究委员会提供的财务和技术支持。