经鼻途径给予减毒活疫苗可有效保护雏鸭免受Riemerella anatipestifer 1型菌的侵害

《Veterinary Microbiology》：Intranasal Delivery of a Live Attenuated Vaccine Confers Efficient Protection against Riemerella anatipestifer Serotype 1 in Ducklings

鸭疫巴氏杆菌（RA）双基因敲除突变体RA-YMΔcas9ΔsprA通过鼻内免疫显著诱导黏膜sIgA和血清IgY抗体，并提升对同源及异源毒株的保护效果，优于肌肉注射。该疫苗安全性高，为国内RA黏膜疫苗开发奠定基础。

　　

侯雅蓉|张洋|黄佳怡|李学迪|杨雪莹|周祖涛|李子莉

华中农业大学兽医学院农业微生物国家重点实验室。中国武汉

摘要

黏膜免疫是动物抵御病原体感染的第一道防线。呼吸道黏膜疫苗能够引发多层次的免疫反应，这对疾病预防和控制具有显著优势。Riemerella anatipestifer（RA）感染会导致鸭子发生传染性浆膜炎，给鸭产业带来持续的经济损失。目前市场上销售的灭活RA疫苗存在一些缺点，如会引起应激反应和残留佐剂。本研究针对中国主要的流行RA血清型1的RA-YM菌株，利用无标记基因敲除技术删除了cas9和sprA毒力基因，构建了双基因缺失突变体RA-YMΔcas9ΔsprA。该突变体的半数致死剂量（LD??）比亲本菌株高2.9×10?倍，表明其毒力显著减弱。7日龄雏鸭通过单次鼻内免疫后，体内产生了高水平的血清IgY和黏膜分泌型IgA（sIgA）抗体，并显著上调了IFN-γ和IL-6等关键细胞因子的表达水平。因此，这种免疫方式能够有效抵御同源亲本菌株及同血清型的异源毒力菌株的侵袭。此外，鼻内免疫的效果优于肌肉注射。这种安全有效的减毒活疫苗为控制RA感染提供了新的策略。

引言

Riemerella anatipestifer（RA）属于Weeksellaceae科，Flavobacteriales目（García-López等人，2019年）。它是一种革兰氏阴性、不产生孢子、兼性厌氧的短杆菌（Wang等人，2025年），主要感染家禽，包括鸭子、鹅、火鸡和鸡（Lv等人，2025年），其中2至3周龄的雏鸭最易感染（Segers等人，1993年）。RA通过呼吸道、消化道和皮肤伤口侵入宿主，导致全身性浆膜炎，典型病理表现为纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎。

数十年来，RA感染的预防工作一直受到血清型多样性和广泛耐药性的限制。迄今为止，已鉴定出21种RA血清型（Pathanasophon等人，2002年），血清型分类主要依据荚膜多糖的抗原结构（Liu等人，2023年）。值得注意的是，不同RA血清型之间的交叉保护作用较差，中国的主要流行血清型为1、2、4、7和11型（Lyu等人，2023年），这些血清型的流行程度在不同地区存在差异。这意味着针对单一血清型开发的疫苗无法满足不同家禽养殖区的防控需求。

在禽类生产中，抗生素的过度使用和不当使用导致多重耐药RA菌株的检出率持续上升，从而缩小了有效抗生素的选择范围。此外，抗生素耐药基因的水平转移可能对生态环境和公共卫生安全构成潜在威胁（Liu等人，2024年；Yang等人，2024年），这进一步凸显了开发新型RA疫苗的紧迫性和必要性。目前报道的RA疫苗包括灭活疫苗、亚单位疫苗（Yang等人，2019年；Zheng等人，2023年）和减毒活疫苗，后者包括基因缺失疫苗（Zou等人，2015年；Liu等人，2018年；Li等人，2023年）以及自然减毒疫苗，这些疫苗均通过注射途径接种。虽然海外已有适合气雾剂或饮用水应用的自然减毒RA疫苗（T. S. Sandhu，1991年；Kang等人，2018年），但中国尚未研发出此类疫苗。目前尚无适用于黏膜免疫的安全有效减毒活RA疫苗，这在国内RA疫苗研究和应用中是一个关键空白。幸运的是，通过鉴定RA的关键毒力因子，为解决这一空白奠定了坚实基础，已明确了多种关键毒力因子，包括铁吸收调节因子Fur（Huang等人，2023年）、烟酰胺酶PncA（Wang等人，2016年）和PhoPR双组分系统（Zhang等人，2022年）。在之前的研究中，我们发现RA-YM携带II-C型CRISPR-Cas系统。RA-YMΔcas9突变体的毒力比亲本菌株RA-YM降低了约317倍，鼻内免疫后能为雏鸭提供满意的免疫保护。这证实Δcas9突变体是开发黏膜减毒活RA疫苗的有希望的候选株（Wang等人，2019年）。除了CRISPR-Cas系统外，其他与毒力相关的基因也是开发RA减毒活疫苗的潜在靶点。sprA基因编码IX型分泌系统（T9SS）的组成部分，负责Flavobacterium johnsoniae中细胞表面滑动黏附素SprB和RemA的分泌（Shrivastava等人，2013年）。在RA中，SprA通过T9SS介导效应蛋白的分泌，促进细菌致病性。ΔsprA突变体的毒力显著减弱（约降低500倍），并且失去了明胶酶活性（Hu等人，2019年），表明sprA基因是开发减毒活RA疫苗的有效靶点。基于以上发现，我们选择了主要流行血清型1的RA-YM菌株作为亲本菌株，构建了无标记双基因缺失突变体RA-YMΔcas9ΔsprA，以评估其作为减毒活疫苗的潜力，旨在解决中国当前RA疫苗的局限性。

实验部分

细菌培养

本研究中使用的血清型1菌株RA-YM保存在我们的实验室中。无标记双基因缺失突变体RA-YMΔcas9ΔsprA是通过无标记基因敲除技术构建的，特异性删除了cas9和sprA基因，且未引入外源性抗生素抗性 cassette。RA菌株通常在添加了5%小牛血清的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上，在5% CO?培养箱中37℃下培养48小时。挑选单个菌落后接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板上

RA-YMΔcas9ΔsprA突变体的构建与鉴定

先前的研究已明确cas9和sprA基因在RA的致病性中起关键作用。首先分别通过PCR扩增了pRE-112质粒以及cas9和sprA基因的上游和下游同源序列（图1A、B、C）。使用两对引物（cas9-L3/cas9-R3和sprA-L3/sprA-R3进行RA-YMΔcas9ΔsprA菌落的鉴定（图1D），并通过测序验证扩增产物（数据未显示）。

讨论

黏膜表面是流感病毒和Mycoplasma spp.等病原体的主要入侵途径，激发局部黏膜免疫反应对于抵御这些感染至关重要（Zhang等人，2024年；Shi等人，2025年）。与传统注射疫苗相比，呼吸道黏膜疫苗不仅能诱导全身免疫反应，还能在病原体入侵部位触发sIgA介导的局部免疫反应，发挥保护作用

结论

RA-YMΔcas9ΔsprA是一种减毒活RA疫苗候选株，具有良好的安全性、遗传稳定性和免疫原性。其核心优势在于通过鼻内给药有效诱导协调的黏膜和体液免疫反应，有效抵御毒力血清型1 RA菌株的侵袭。本研究为新型RA黏膜活疫苗的开发提供了技术基础，其设计策略也为

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2023YFD1800200）和中国国家自然科学基金（项目编号31872498）的支持。

作者贡献声明

黄佳怡：研究工作。张洋：方法学研究。李学迪：研究工作。周祖涛：监督和资金获取。杨雪莹：研究工作。李子莉：资源准备和资金获取。侯雅蓉：撰写初稿、数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。